Integrazione di approcci omici per la caratterizzazione di batteri intestinali chiave: dalla modulazione della comunità microbica all’analisi funzionale del singolo ceppo

The human gut microbiota is a complex microbial ecosystem essential for host homeostasis and health. While disruptions in this community are associated with inflammatory and metabolic disorders, translating these associations into therapeutic applications remains challenging due to the complexity of microbial communities, inter-individual variability, and limited understanding of how specific bacterial taxa respond to interventions and environmental changes. Developing effective microbiota-based strategies requires both targeted modulation of bacterial groups and comprehensive characterisation of key taxa at multiple scales, from community composition to individual strain function. This thesis integrates targeted modulation studies, systematic phylogenetic and functional characterisation of relevant bacterial groups, and strain-level regulatory profiling to advance our understanding of gut microbiota ecology and manipulation. In the context of microbiota modulation, we focused on Enterobacteriaceae, a bacterial family highly enriched in dysbiotic conditions and associated with various inflammatory pathologies. In vitro screening of 20 strains isolated from healthy individuals identified long-chain inulin and xylooligosaccharides as prebiotics capable of selectively inhibiting Enterobacteriaceae growth. This prebiotic mixture was tested in a murine atherosclerosis model, both alone and in combination with red yeast rice extract. Metagenomic analysis of fecal samples after twenty weeks showed a decrease in Enterobacteriaceae abundance in the group treated with the combination. Clinical evaluation revealed an improvement in disease-related parameters, suggesting potential therapeutic benefits of targeted microbiota modulation. Clostridia represent one of the most abundant bacterial classes in the gut microbiota, playing essential roles in carbohydrate fermentation and short-chain fatty acid production. To characterise the diversity and functional potential of this taxonomically complex group, we conducted a comprehensive phylogenetic analysis of 1,897 intestinal Clostridia representative species from the Unified Human Gastrointestinal Genome database. Genomic screening identified species harbouring butyrate and propionate biosynthetic pathways, whose distribution was assessed across 151 healthy metagenomes. This integrated analysis linked clostridial phylogenetic diversity to functional capacity and abundance patterns in the healthy human gut. Subsequently, we further investigated this bacterial class through whole-genome sequencing of Intestinibacter bartlettii WC0582, a strain isolated from a healthy individual. The complete genome, obtained through hybrid assembly, was analysed to describe the genetic features, functional potential, and ecological role of this still poorly characterised species. Finally, we explored bacterial gene regulation through systematic transcriptomic profiling of Lacticaseibacillus rhamnosus GG, one of the most widely used probiotic strains worldwide. Despite its extensive application, the regulatory networks governing LGG responses to intestinal conditions remain largely uncharacterised, potentially contributing to variable clinical outcomes. We subjected LGG to 26 different environmental perturbations, including temperature shifts, osmotic and oxidative stress, and pH variations, as well as nutrient limitations and supplementation with relevant compounds such as short-chain fatty acids and mucin components. This transcriptomic analysis offers details useful for a deeper comprehension of LGG gene regulatory responses to diverse environmental conditions.

Il microbiota intestinale umano è un ecosistema microbico complesso, essenziale per l'omeostasi e la salute dell'ospite. Sebbene le alterazioni di questa comunità siano associate a disturbi infiammatori e metabolici, tradurre queste associazioni in applicazioni terapeutiche rimane una sfida a causa della complessità delle comunità microbiche, della variabilità interindividuale e della limitata comprensione di come specifici taxa batterici rispondano a stimoli esterni e cambiamenti ambientali. Lo sviluppo di strategie efficaci basate sul microbiota richiede sia la modulazione mirata di gruppi batterici, sia la caratterizzazione approfondita di taxa chiave a diversi livelli, dalla composizione della comunità fino alle caratteristiche funzionali dei singoli ceppi. Questa tesi integra studi di modulazione mirata, caratterizzazione filogenetica e funzionale di gruppi batterici rilevanti ed analisi regolatoria a livello di singolo ceppo, per ampliare la comprensione dell'ecologia del microbiota intestinale e delle sue possibilità di manipolazione. Nel contesto della modulazione del microbiota, abbiamo posto l’attenzione sulle Enterobacteriaceae, una famiglia batterica fortemente arricchita in condizioni disbiotiche e associata a diverse patologie infiammatorie. Lo screening in vitro di 20 ceppi isolati da individui sani ha identificato l'inulina a catena lunga e gli xilooligosaccaridi come prebiotici capaci di inibire selettivamente la crescita delle Enterobacteriaceae. Questa miscela prebiotica è stata testata in un modello murino di aterosclerosi, sia da sola che in combinazione con estratto di riso rosso fermentato. L'analisi metagenomica dei campioni fecali dopo 20 settimane ha mostrato una diminuzione dell'abbondanza delle Enterobacteriaceae nel gruppo trattato con la combinazione. La valutazione clinica ha mostrato un miglioramento dei parametri correlati alla malattia, suggerendo potenziali benefici terapeutici della modulazione mirata del microbiota. I Clostridia rappresentano una delle classi più abbondanti nel microbiota intestinale, con ruoli essenziali nella fermentazione dei carboidrati e nella produzione di acidi grassi a catena corta. Per caratterizzare la diversità e il potenziale funzionale di questo gruppo tassonomicamente complesso, abbiamo condotto un'analisi filogenetica di 1897 specie rappresentative di Clostridia intestinali del database Unified Human Gastrointestinal Genome. Lo screening genomico ha identificato le specie dotate di vie biosintetiche per butirrato e propionato, la cui distribuzione è stata valutata in 151 metagenomi di soggetti sani. In seguito, abbiamo approfondito l’analisi di questa classe batterica mediante il sequenziamento del genoma di Intestinibacter bartlettii WC0582, un ceppo isolato da un soggetto sano. Il genoma, ottenuto tramite hybrid assembly, è stato analizzato per descriverne le caratteristiche genetiche, le potenzialità funzionali e il ruolo ecologico di questa specie ancora poco caratterizzata. Infine, abbiamo esplorato la regolazione genica batterica attraverso l'analisi trascrittomica di Lacticaseibacillus rhamnosus GG, uno dei ceppi probiotici più utilizzati al mondo. Nonostante il suo largo impiego, le reti di regolazione genica di LGG rimangono in gran parte non caratterizzate, contribuendo potenzialmente alla variabilità degli esiti clinici. Abbiamo sottoposto LGG a 26 diverse perturbazioni ambientali, fra cui variazioni di temperatura, stress osmotico e ossidativo, variazioni di pH, oltre a limitazioni di nutrienti e supplementi di composti rilevanti quali acidi grassi a catena corta e componenti della mucina. Questa analisi trascrittomica fornisce dettagli utili per una comprensione più approfondita delle risposte regolatorie geniche di LGG a diverse condizioni ambientali.