H3.3A e H3.3B: distribuzione regionale ed espressione cellulare delle isoforme della variante istonica H3.3 in diverse condizioni fisiologiche

Histone variants play a fundamental role in the complex scenery of epigenetic dynamics and chromatin remodelling; their replication-independent incorporation into chromatin and rapid turnover have recently suggested their involvement in central nervous system (CNS) pathophysiology and plasticity, though their precise role is still to be elucidated. The H3.3 histone variant, highly expressed in the brain, is encoded by two different intron-containing genes namely H3f3a and H3f3b. Although the coded proteins, H3.3A and H3.3B respectively, are identical, knocking out H3f3b generates a more severe phenotype compared to H3f3a, suggesting the lack of a complete functional overlap. This different impact may derive from a differential cell-type expression and regional distribution in the CNS. In order to investigate the functional role of H3.3 variant expression in the CNS it is therefore necessary to clarify the localization and cellular expression of the two isoforms. This will permit to define whether H3.3A and H3.3B turnover, alone or together, participates to molecular mechanisms that lead to neuroplasticity in specific neuronal circuits and associated functions. In this project, hemagglutinin (HA)-tagged H3.3A (WT/HA-fH3.3A) and HA-tagged H3.3B (WT/HA-fH3.3B) mice were used to perform a detailed analysis of H3.3 isoform distribution in CNS white and grey matter regions, by using semi-quantitative immunohistochemistry (IHC). Moreover, cell-specific expression of these proteins was assessed by using specific antibodies against microglia, astrocytes, oligodendrocytes and neurons through double immunofluorescent (IF) stainings and high-resolution confocal microscopy. H3.3A and H3.3B have a widespread though different region-specific distribution and, as concerns their cellular expression, they are mostly, though not exclusively, expressed by neurons. Innovative techniques such as tissue clearing and lightsheet microscopy allowed us to obtain an overall view of H3.3 isoform distribution in the whole brain. Finally, we investigated the possible changes in H3.3 expression in various physiological conditions, including ageing and exposure to an enriched environment, a procedure that models the neurotrophic and neuroprotective impact of high educational attainment in humans. In this latter model, an increased expression of H3.3B variant in specific brain areas and cell types was observed. Our results demonstrate for the first time a different regional distribution and cellular expression of the two H3.3 isoforms in the mouse CNS as well as their changes in various physiological conditions. This opens up a path to the generation of cell-population specific conditional knock-out mice to elucidate H3.3 isoform contribution to the function of precise cerebral circuits.

Le varianti istoniche svolgono un ruolo fondamentale nel complesso scenario dell’epigenetica e del rimodellamento della cromatina; l’evidenza della loro incorporazione replicazione-indipendente all’interno della cromatina e di un turnover rapido hanno recentemente portato a ipotizzare un loro coinvolgimento nella fisiopatologia e plasticità del sistema nervoso centrale (SNC), ma rimane ancora da chiarire quale parte svolgano in questi processi. La variante istonica H3.3, altamente espressa nel cervello, è codificata da due diversi geni chiamati H3f3a e H3f3b. Sebbene le proteine che ne derivano, rispettivamente H3.3A e H3.3B, siano identiche, inattivando H3f3b si genera un fenotipo più grave rispetto a H3f3a, il che suggerisce la mancanza di una completa sovrapposizione funzionale. Questi diversi fenotipi potrebbero derivare da una diversa espressione cellulo-specifica e distribuzione regionale nel SNC delle due isoforme. Al fine di comprendere il ruolo funzionale dell’espressione della variante H3.3 nel SNC è necessario dunque chiarire la localizzazione e l'espressione cellulare delle due isoforme. Questo consentirà di definire se il turnover di H3.3A e H3.3B, singolarmente o insieme, è alla base di processi neuroplastici e alterazioni funzionali in specifici circuiti neuronali. In questo progetto di tesi sono stati usati topi H3.3A (WT/HA-fH3.3A) e H3.3B (WT/HA-fH3.3B) che esprimono un tag di emoagglutinina (HA) per eseguire un'analisi dettagliata della distribuzione delle isoforme di H3.3, nelle regioni di sostanza bianca e grigia del SNC, tramite immunoistochimica (IHC) semi-quantitativa. È stata inoltre valutata l’espressione cellulo-specifica di queste proteine mediante l’utilizzo di anticorpi diretti contro microglia, astrociti, oligodendrociti e neuroni grazie a tecniche di doppia immunofluorescenza e microscopia confocale ad alta risoluzione. H3.3A e H3.3B hanno una differente distribuzione nel SNC, per entrambe molto diffusa ma eterogenea, e, per quanto riguarda la loro espressione cellulare, sono per la maggior parte, ma non esclusivamente, espresse dai neuroni. Tecniche innovative quali la chiarificazione dei tessuti e la microscopia a foglio di luce hanno permesso di ottenere una visione d’insieme della localizzazione delle isoforme di H3.3 nell’intero cervello. Abbiamo infine studiato i possibili cambiamenti nell’espressione di H3.3 in diverse condizioni fisiologiche, quali l’invecchiamento e l’esposizione ad ambiente arricchito, una procedura che mima gli effetti neurotrofici e neuroprotettivi di un livello elevato di istruzione negli uomini. In quest’ultimo modello, è stato osservato un incremento nell’espressione di H3.3B in specifiche aree cerebrali e specifici tipi cellulari. I nostri risultati descrivono per la prima volta la precisa distribuzione regionale ed espressione cellulare delle due isoforme di H3.3 nel SNC di topo così come i loro cambiamenti in varie condizioni fisiologiche. Questo studio apre la strada alla generazione di topi knock-out condizionali per specifiche popolazioni cellulari al fine di comprendere il contributo delle isoforme di H3.3 in specifici circuiti cerebrali.