Utilizzo della metodica EMA-qPCR per la stima delle cellule vitali di Legionella spp.

OBIETTIVI: La PCR quantitativa (qPCR) è una metodica utilizzata da tempo per la stima di patogeni in campioni ambientali e clinici. Nonostante offra diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali colturali, il principale ostacolo per una maggiore diffusione del metodo è rappresentato dalla mancanza di informazioni circa la vitalità o meno delle cellule microbiche. Il presente studio ha verificato l’applicabilità in laboratorio di un nuovo metodo quantitativo (EMA-qPCR) per distinguere le cellule morte di Legionella spp da quelle vitali mediante l’uso di bromuro di etidio monoazide (EMA). Questo colorante entra selettivamente nelle cellule con membrana danneggiata intercalandosi al DNA ed impedendone l’amplificazione. METO DI: Sono stati allestiti saggi sperimentali (L. pneumophila ATCC 33152) in cui legionelle in fase esponenziale di crescita (cellule vive) e legionelle uccise al calore (cellule morte) venivano trattate con EMA a diverse concentrazioni (1,5-3-6-12,5-50-100 μM) in presenza di luce (500W). Dopo estrazione del DNA, la reazione di qPCR veniva condotta utilizzando il LightMix kit Legionella spp che permette l’amplificazione di un frammento (386 bp) del gene 16S. Le unità genomiche venivano calcolate confrontando le concentrazioni ottenute con quelle di una curva di calibrazione e con legionelle non trattate con EMA. Su tutti i campioni veniva eseguito anche l’esame colturale (ISO-11731) per la ricerca di Legionella spp. RISULTATI : I risultati delle analisi di EMA-qPCR mostrano che l’amplificazione del DNA estratto da 3x105 UFC/L di legionelle uccise veniva completamente inibita con concentrazioni di EMA da 100 a 6 μM. Il trattamento di un’ analoga concentrazione di legionelle vive con 6 μM di EMA non determinava una riduzione del numero di unità genomiche rispetto a quelle ottenute dalle analisi di qPCR di cellule non trattate con EMA. Concentrazioni di EMA superiori a 6 μM causavano invece inibizione parziale o totale dell’amplificazione del DNA delle cellule vitali a causa della tossicità del colorante. CONCLUSIONI: I nostri dati dimostrano che l’utilizzo del bromuro di etidio monoazide (EMA) in combinazione con la qPCR è un metodo in grado di distinguere la presenza di legionelle vive da quelle morte. Questi risultati indicano che la scelta della concentrazione di EMA deve tener conto della tossicità del colorante. Ulteriori indagini sono in corso per verificare quanto colorante sia necessario in funzione della concentrazione di Legionella spp nel campione ambientale.