La tecnica dell'incapsulamento applicata alla conservazione delle orchidee spontanee

LA TECNICA DELL’INCAPSULAMENTO APPLICATA ALLA CONSERVAZIONE DELLE ORCHIDEE SPONTANEEElisabetta SGARBI1, Maddalena GRIMAUDO21 Dipartimento di Scienze agrarie e degli alimenti, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, via Amendola 2, Padiglione Besta, 42100 Reggio Emilia. e-mail: elisabetta.sgarbi@unimore.it2 Dipartimento del Museo di Paleobiologia e dell’Orto Botanico,Università di Modena e Reggio Emilia, viale Caduti in Guerra 127, 41100 Modena.Un aspetto interessante della biologia delle orchidee riguarda i semi, che sono piccolissimi e mancano di endosperma e di cotiledone. Nell’ambiente naturale le poche sostanze di riserva presenti nell’embrione consentono solo le prime fasi della germinazione, in attesa che si stabilisca una relazione micorrizica con funghi simbionti: questi sostengono lo sviluppo del protocormo e della plantula fino al raggiungimento di un’efficiente attività fotosintetica. In laboratorio la germinazione può avvenire anche asimbioticamente, in vitro, fornendo nel substrato di coltura le sostanze nutritive che occorrono e applicando specifici protocolli per l’interruzione della dormienza. Le tecniche di colture in vitro sono indispensabili per la propagazione delle orchidee da seme, garantendo la conservazione della biodiversità intraspecifica. In questo contesto si inserisce la possibilità di applicare la tecnologia dell’incapsulamento per la crioconservazione dei protocormi che si ottengono dopo le prime fasi di germinazione, selezionando quelli a più rapida velocità di crescita e sicuramente vitali. L’approccio sperimentale adottato prevede che i protocormi, una volta incapsulati in alginato, siano sottoposti a protocolli di osmoprotezione (utilizzando una soluzione glicerolo 2 M e saccarosio 0,4 M). Successivamente si procede con la disidratazione, indotta immergendo le perle di alginato in una soluzione vitrificante, la PVS2 (1), da anni utilizzata con successo con diversi tipi di espianti (2, 3). La PVS2, costituita da glicerolo, etilenglicole, saccarosio e DMSO aggiunti ad un substrato di coltura, presenta elevata molarità e induce un drastico aumento della viscosità cellulare, riconducibile ad una concentrazione dei soluti delle cellule, evitando così la formazione di cristalli durante il successivo congelamento in azoto liquido (4). In questa fase due importanti variabili, tra loro correlate, devono essere testate per garantire la sopravvivenza dei protocormi: durata del trattamento con la PVS2 e temperatura a cui avviene la vitrificazione (3). Lo scongelamento, ultrarapido, a 40 °C per 2 minuti, è seguito dal recupero dei protocormi incapsulati e da una progressiva reidratazione, ottenuta sottoponendo i campioni a lavaggi con soluzioni di saccarosio a molarità decrescente. La correttezza del processo di crioconservazione viene verificata applicando il test di vitalità al TTC e, in parallelo, ponendo in coltura i protocormi, mantenuti sempre all’interno delle perle di alginato. La tecnica dell’incapsulamento si configura come un ottimo metodo per proteggere i protocormi durante le varie fasi del trattamento di crioconservazione e nella successiva fase di messa in coltura, garantendo una rapida ripresa della crescita.1)Sakai, Kobayash & Oiyama (1990). Plant Cell Rep. 9: 30-33.2)Sakai & Engelmann (2007). CryoLetters 28: 151-172.3)Lambardi & De Carlo (2009). Italus Hortus 16: 79-98.4)Benson (2008). In: Reed (ed.) Plant Cryopreservation: A practical guide. Springer, New York