La tecnologia siRNAs (Small Interfering RNAs) è una innovativa strategia di regolazione genica post-trascrizionale potenzialmente applicabile in diversi campi della medicina ed in particolare in campo oncologico. [1] I siRNAs sono piccole sequenze di RNA a doppio filamento che a livello citoplasmatico subiscono un processo di attivazione mediato da un complesso sistema enzimatico denominato RISC (RNA induced silencing complexes) e divengono capaci di riconoscere e “silenziare” l’RNA target. In particolare le nostre ricerche sono indirizzate al linfoma effusivo delle cavità sierose (PEL). Si tratta di un raro tipo di linfoma di tipo non Hodgkin il cui agente eziologico è l’oncovirus HHV-8; nonostante i differenti approcci chemioterapici tentati, ad oggi non esiste un trattamento farmacologico efficace [2]. La disregolazione specifica mediata da siRNA del network di trascrizione della cellula malata potrebbe rappresentare una possibile alternativa nel trattamento della patologia. Considerando l’instabilità in vivo dei siRNAs associata alla loro scarsa capacità di penetrazione cellulare, il successo della strategia di silenziamento è strettamente dipendente dall’utilizzo di sistemi di delivery capaci di proteggere e trasportare selettivamente l’attivo nella cellula malata [3]. I liposomi, ed in particolare quelli cationici, sono sistemi di veicolazione e direzionamento innovativi, studiati e utilizzati da diversi anni, per la loro capacità di stabilizzare e trasferire materiale genico al bersaglio; la modificazione superficiale con molecole stabilizzanti (es PEG) e ligando selettive quali anticorpi monoclonali, peptidi ed aptameri garantisce la veicolazione e selettività del sistema [4,5].In studi preliminari, abbiamo dimostrato come sistemi liposomiali “stealth” modificati con anticorpo anti CD-138 specificamente riconosciuto da proteoglicani largamente espressi sulle cellule linfomatose, risultino altamente efficienti nella complessazione e stabilizzazione di materiale genico. Tali immunoliposomi sono stati testati quali carriers di un oligonucleotide modello (ODN-FITC) su cellule BCBL-1 (linea cellulare di PEL) evidenziando una buona capacità di trasferimento e di targeting valutata mediante citofluorimetria e microscopia confocale [6]. Tali evidenze sono risultate basilari per intraprendere nuovi studi di ottimizzazione di sistemi veicolanti siRNAs specifici nel silenziamento di fattori trascrizionali dominanti dello stadio plasmacellulare (knock-down di BLIMP-1/PRDM) in cellule PEL.In questa ricerca sono stati dapprima formulati e caratterizzati vettori liposomiali (Lp) utilizzando lipidi cationici (Dotap e DC-Chol) e neutri (Dope e Pc). Sono stati così selezionati i vettori che presentavano migliori caratteristiche in termini di dimensioni, carica superficiale e stabilità ed è stata valutata la loro capacità di complessare e stabilizzare siRNAs anti BLIMP-1. I complessi ottimizzati sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico fisico mediante PCS e AFM ed è stata valutata l’efficienza di complessazione mediante elettroforesi su gel di agarosio. I dati hanno evidenziato come i liposomi allestiti con il lipide cationico Dotap risultino quelli maggiormente idonei alla formazione di lipoplexes idonei alla somministrazione: caratterizzati da strutture definite e riproducibili, di dimensioni prossime a 350nm che efficientemente proteggono i siRNAs, mostrando inoltre una buona stabilità dopo incubazione in siero. I lipoplexes allestiti con Dotap sono inoltre stati testati in vitro sulla linea cellulare BCBL-1, tali vettori sono risultati atossici in un ampio range di concentrazioni ed abili nel trasferire il materiale genico a livello citoplasmatico. In particolare è stato valutato l’effetto mediato dall’inibizione della proteina bersaglio mediante determinazione della proliferazione cellulare (analisi citomorfologica e conta cellulare) e test annessina/propidio per valutare l’induzione di necrosi e apoptosi, osservando un effetto dose dipendente dopo 48/72 ore a concentrazioni superiori a 50nM con una inibizione della proliferazione cellulare superiore all’80%. E’ stata inoltre valutata la peghilazione come strategia per aumentare il tempo di permanenza in circolo oltre ad offrire il supporto per il legame con anticorpi specifici verso il PEL (anti CD-138).[1] Oh YK, Park TG (2009). Adv. Drug Deliv Rev. 61: 850–862.[2] Carbone A, Gloghini A (2007). BJH review. 140: 13–24.[3] Whitehea KA , Langer R, Anderson DG (2009). Nature Review. 8:129-138.[4] Ruozi B, Belletti D, Tombesi A, Tosi G, Bondioli L, Forni F, Vandelli M A (2011). Int J Nanomed. 6:557–563.[5] Ruozi B, Battini R, Montanari M, Mucci A, Tosi G, Forni F, Vandelli M A (2007). Nanomedicine:NBM. 3: 1-13.[6] Ruozi B, Riva G, Belletti D, Tosi G, Barozzi P, Luppi M, Forni F, Vandelli MA (2010). Nanomedicine UK 5:1051-1064.

Complessazione di SiRNA anti Blimp-1/PRDM con liposomi cationici: caratterizzazione chimico-fisica e validazione in vitro su cellule di PEL / Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Forni, Flavio; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Tosi, Giovanni; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara. - STAMPA. - (2011), pp. 1-1. ((Intervento presentato al convegno XI Scuola Dottorale per la Formazione Avanzata in Discipline Tecnologico-Farmaceutiche tenutosi a Arcavacata di Rende nel 11-15 Settembre 2011.

Complessazione di SiRNA anti Blimp-1/PRDM con liposomi cationici: caratterizzazione chimico-fisica e validazione in vitro su cellule di PEL

BELLETTI, Daniela;RIVA, Giovanni;FORNI, Flavio;BAROZZI, Patrizia;LUPPI, Mario;TOSI, Giovanni;VANDELLI, Maria Angela;RUOZI, Barbara
2011

Abstract

La tecnologia siRNAs (Small Interfering RNAs) è una innovativa strategia di regolazione genica post-trascrizionale potenzialmente applicabile in diversi campi della medicina ed in particolare in campo oncologico. [1] I siRNAs sono piccole sequenze di RNA a doppio filamento che a livello citoplasmatico subiscono un processo di attivazione mediato da un complesso sistema enzimatico denominato RISC (RNA induced silencing complexes) e divengono capaci di riconoscere e “silenziare” l’RNA target. In particolare le nostre ricerche sono indirizzate al linfoma effusivo delle cavità sierose (PEL). Si tratta di un raro tipo di linfoma di tipo non Hodgkin il cui agente eziologico è l’oncovirus HHV-8; nonostante i differenti approcci chemioterapici tentati, ad oggi non esiste un trattamento farmacologico efficace [2]. La disregolazione specifica mediata da siRNA del network di trascrizione della cellula malata potrebbe rappresentare una possibile alternativa nel trattamento della patologia. Considerando l’instabilità in vivo dei siRNAs associata alla loro scarsa capacità di penetrazione cellulare, il successo della strategia di silenziamento è strettamente dipendente dall’utilizzo di sistemi di delivery capaci di proteggere e trasportare selettivamente l’attivo nella cellula malata [3]. I liposomi, ed in particolare quelli cationici, sono sistemi di veicolazione e direzionamento innovativi, studiati e utilizzati da diversi anni, per la loro capacità di stabilizzare e trasferire materiale genico al bersaglio; la modificazione superficiale con molecole stabilizzanti (es PEG) e ligando selettive quali anticorpi monoclonali, peptidi ed aptameri garantisce la veicolazione e selettività del sistema [4,5].In studi preliminari, abbiamo dimostrato come sistemi liposomiali “stealth” modificati con anticorpo anti CD-138 specificamente riconosciuto da proteoglicani largamente espressi sulle cellule linfomatose, risultino altamente efficienti nella complessazione e stabilizzazione di materiale genico. Tali immunoliposomi sono stati testati quali carriers di un oligonucleotide modello (ODN-FITC) su cellule BCBL-1 (linea cellulare di PEL) evidenziando una buona capacità di trasferimento e di targeting valutata mediante citofluorimetria e microscopia confocale [6]. Tali evidenze sono risultate basilari per intraprendere nuovi studi di ottimizzazione di sistemi veicolanti siRNAs specifici nel silenziamento di fattori trascrizionali dominanti dello stadio plasmacellulare (knock-down di BLIMP-1/PRDM) in cellule PEL.In questa ricerca sono stati dapprima formulati e caratterizzati vettori liposomiali (Lp) utilizzando lipidi cationici (Dotap e DC-Chol) e neutri (Dope e Pc). Sono stati così selezionati i vettori che presentavano migliori caratteristiche in termini di dimensioni, carica superficiale e stabilità ed è stata valutata la loro capacità di complessare e stabilizzare siRNAs anti BLIMP-1. I complessi ottimizzati sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico fisico mediante PCS e AFM ed è stata valutata l’efficienza di complessazione mediante elettroforesi su gel di agarosio. I dati hanno evidenziato come i liposomi allestiti con il lipide cationico Dotap risultino quelli maggiormente idonei alla formazione di lipoplexes idonei alla somministrazione: caratterizzati da strutture definite e riproducibili, di dimensioni prossime a 350nm che efficientemente proteggono i siRNAs, mostrando inoltre una buona stabilità dopo incubazione in siero. I lipoplexes allestiti con Dotap sono inoltre stati testati in vitro sulla linea cellulare BCBL-1, tali vettori sono risultati atossici in un ampio range di concentrazioni ed abili nel trasferire il materiale genico a livello citoplasmatico. In particolare è stato valutato l’effetto mediato dall’inibizione della proteina bersaglio mediante determinazione della proliferazione cellulare (analisi citomorfologica e conta cellulare) e test annessina/propidio per valutare l’induzione di necrosi e apoptosi, osservando un effetto dose dipendente dopo 48/72 ore a concentrazioni superiori a 50nM con una inibizione della proliferazione cellulare superiore all’80%. E’ stata inoltre valutata la peghilazione come strategia per aumentare il tempo di permanenza in circolo oltre ad offrire il supporto per il legame con anticorpi specifici verso il PEL (anti CD-138).[1] Oh YK, Park TG (2009). Adv. Drug Deliv Rev. 61: 850–862.[2] Carbone A, Gloghini A (2007). BJH review. 140: 13–24.[3] Whitehea KA , Langer R, Anderson DG (2009). Nature Review. 8:129-138.[4] Ruozi B, Belletti D, Tombesi A, Tosi G, Bondioli L, Forni F, Vandelli M A (2011). Int J Nanomed. 6:557–563.[5] Ruozi B, Battini R, Montanari M, Mucci A, Tosi G, Forni F, Vandelli M A (2007). Nanomedicine:NBM. 3: 1-13.[6] Ruozi B, Riva G, Belletti D, Tosi G, Barozzi P, Luppi M, Forni F, Vandelli MA (2010). Nanomedicine UK 5:1051-1064.
XI Scuola Dottorale per la Formazione Avanzata in Discipline Tecnologico-Farmaceutiche
Arcavacata di Rende
11-15 Settembre 2011
1
1
Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Forni, Flavio; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Tosi, Giovanni; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara
Complessazione di SiRNA anti Blimp-1/PRDM con liposomi cationici: caratterizzazione chimico-fisica e validazione in vitro su cellule di PEL / Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Forni, Flavio; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Tosi, Giovanni; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara. - STAMPA. - (2011), pp. 1-1. ((Intervento presentato al convegno XI Scuola Dottorale per la Formazione Avanzata in Discipline Tecnologico-Farmaceutiche tenutosi a Arcavacata di Rende nel 11-15 Settembre 2011.
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