Genomica funzionale basata su CRISPR per migliorare la produzione di rAAV: applicazione in muscolo scheletrico 3D

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are leading gene therapy tools thanks to non-pathogenicity, low immunogenicity, and broad tissue tropism. Their use has been approved by FDA and EMA for several therapeutic protocols and nearly all commercially approved AAV-based products are produced via triple transfection in HEK293 cells. However, existing production platforms may not meet the growing demand for large-scale in-vivo applications, emphasizing the need for improved manufacturing. In parallel, patient deaths observed in recent AAV clinical trials have limited translation to the clinic highlighting the need for advanced in vitro models that better mimic the in vivo microenvironment to accurately evaluate AAV behavior and safety. To these aims, firstly, CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) pooled human library was employed to discover host genes whose upregulation boosts rAAV yield in ReiCells, packaging cells routinely used by ReiThera for clinical-grade adenoviral vectors. Secondly, in collaboration with Tedesco’s laboratory (UCL and The Francis Crick Institute), a fully humanized 3D skeletal muscle platform was applied to evaluate multiple AAV serotypes in a physiologically relevant system. ReiCells were engineered via lentiviral delivery to stably express the SAM machinery (SAM-ReiCells). A gRNA library of 70,290 guides targeting promoters of 23,430 human genes was cloned into an rAAV plasmid (AAVgRNA_EGFP). Next-generation sequencing confirmed 99.7% gRNA retention after cloning and vector production, indicating high library complexity. The library was rescued and serially amplified in SAM-ReiCells using an Ad-helper plasmid and Rep/Cap plasmids encoding AAV8 or AAVDJ capsids. Viral genomes from the final amplification were PCR-amplified and analysed by targeted NGS to identify enriched gRNAs linked to genes whose activation benefits rAAV production. Initial analyses yielded 454 and 157 enriched gRNAs (fold change > 2) in AAV8 and AAVDJ, respectively. Comparative analysis revealed five gRNAs commonly enriched across both capsids, and, among those, the top-ranked showed 1,814-fold (AAV8) and 644-fold (AAVDJ) enrichment. Stable expression of this gRNA in SAM-ReiCells increased rAAV yield by up to 1.7-fold compared to controls. Vectors generated from the engineered line also improved infectivity in HEK293T cells, reducing the Vg/TU ratio up to 0.60 (Vg/TU obtained in SAM-ReiCells with a negative control gRNA set as 1), suggesting higher vector quality. Moreover, AAV as a therapeutic vector should achieve robust transgene expression in target cells at the lowest feasible vector copy number to mitigate risk, therefore, Tedesco’s fully humanized 3D muscle technology was employed to test ten AAV serotypes in single-lineage constructs from immortalized myoblasts (AB1190) or iPSC-derived myoblasts (NCRM1), and in bi-lineage 3D muscle combining iPSC-derived myoblasts (NCRM1) and iPSC-derived lower motoneurons (i3LMNs). Using live imaging, fluorescent reporter expression was tracked over time to quantify transduction efficiency, tissue specificity, and expression kinetics during tissue maturation. The results identified serotypes delivering higher GFP expression at lower vector copy numbers, indicating a delivery strategy that supports strong therapeutic expression with improved safety in a muscle microenvironment. Our findings outline a dual strategy to enhance rAAV-based therapies by boosting production efficiency and vector quality through host-cell engineering and refining the assessment of AAV serotype performance using advanced humanized 3D muscle models that more accurately reflect in vivo conditions. This integrated approach addresses manufacturing scalability while strengthening preclinical relevance.

I vettori adeno-associati (AAV) sono tra i sistemi più efficaci nella terapia genica grazie alla loro natura non patogena, alla bassa immunogenicità e all’ampio tropismo. Diversi protocolli terapeutici basati su AAV sono stati approvati da FDA ed EMA. Questi prevedendo la produzione dei vettori mediante tripla trasfezione in cellule HEK293, tuttavia, le piattaforme attuali non soddisfano la crescente richiesta per applicazioni in vivo su larga scala, evidenziando la necessità di processi produttivi più efficienti. Parallelamente, i decessi osservati in recenti studi clinici ne hanno limitato la traslazione clinica, sottolineando l’urgenza di modelli avanzati che riproducano il microambiente in vivo per valutarne accuratamente comportamento e sicurezza. A tale scopo, è stata impiegata la libreria umana CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) per identificare geni la cui sovraespressione potesse incrementare la resa di rAAV nelle ReiCells, cellule di packaging usate da ReiThera per produrre vettori adenovirali. Inoltre, in collaborazione con il laboratorio di Tedesco (UCL e The Francis Crick Institute), è stato utilizzato un modello 3D di muscolo scheletrico per valutare diversi sierotipi di AAV in un sistema fisiologico. Le ReiCells sono state ingegnerizzate con vettori lentivirali per esprimere il sistema SAM (SAM-ReiCells). Una libreria di 70.290 gRNA, dirette ai promotori di 23.430 geni, è stata clonata in un plasmide rAAV (AAVgRNA_EGFP). Il sequenziamento di nuova generazione ha confermato il mantenimento del 99,7% delle guide dopo clonaggio, dimostrando l’elevata complessità della libreria, poi amplificata serialmente nelle SAM-ReiCells usando un plasmide Ad-helper e plasmidi Rep/Cap codificanti per i capsidi AAV8 o AAVDJ. I genomi virali dell’ultimo ciclo di amplificazione sono stati sequenziati per individuare gRNA arricchiti associati a geni la cui attivazione favorisce la produzione di rAAV. Le analisi hanno identificato 454 e 157 gRNA arricchiti (arricchimento>2) per AAV8 e AAVDJ. Cinque gRNA sono risultati comuni tra i due sierotipi, di cui il migliore ha mostrato un incremento di 1.814 volte (AAV8) e 644 volte (AAVDJ). La sua espressione stabile nelle SAM-ReiCells ha aumentato la resa di rAAV fino a 1,7 volte rispetto ai controlli. I vettori prodotti da questa linea hanno inoltre mostrato maggiore infettività in cellule HEK293T, con una riduzione del rapporto Vg/TU a 0,60 (controllo negativo settato a 1) indicando una qualità superiore. Poiché i vettori AAV devono garantire un’elevata espressione del transgene con il minor numero possibile di copie per motivi di sicurezza, sono stati utilizzati i modelli 3D muscolari del gruppo di Tedesco per testare dieci sierotipi di AAV in costrutti derivati da mioblasti immortalizzati (AB1190) o da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC, NCRM1), nonché in modelli composti da mioblasti (NCRM1) e motoneuroni inferiori (i3LMNs) derivati da iPSC. Tramite acquisizioni in tempo reale, l’espressione del transgene è stata monitorata nel tempo per valutare efficienza di trasduzione, specificità e cinetica di espressione durante la maturazione del tessuto. I risultati hanno evidenziato sierotipi capaci di fornire un’elevata espressione del transgene con un numero ridotto di copie, garantendone una forte espressione in condizioni di maggiore sicurezza. Nel complesso, questo studio delinea una strategia per potenziare le terapie basate su rAAV aumentandone efficienza produttiva e qualità tramite l’ingegnerizzazione delle cellule ospiti, e migliorando la valutazione dei sierotipi mediante modelli muscolari umanizzati 3D che riproducono con maggiore fedeltà le condizioni fisiologiche. Questo approccio affronta congiuntamente la scalabilità produttiva e la rilevanza preclinica.