Ruolo delle Fosfolipasi C fosfoinositide-specifiche (PLC) nei meccanismi di adesione e meccanotrasduzione in cellule di osteosarcoma umano 143B.

Osteosarcoma (OS) is a rare and highly aggressive primary bone cancer that mainly affects children and young adults. It is often diagnosed at advanced stages, and poor prognosis is largely due to metastatic spread. The molecular mechanisms underlying OS progression remain poorly understood. Recent evidence indicates that the phosphoinositide pathway and phospholipase C (PLC) isoforms are Aldo involved in key processes of bone development and tumor progression. This study aimed to explore how PLC modulation influences OS cell growth, survival and motility through pharmacological inhibition and isoform-specific silencing. Our results show how PLCs inhibitor U73122 significantly reduces the cell growth rate compared to untreated cell controls and to cells treated with an inactive analogue. We observed a possible regulatory interplay between PLCβ2 and PLCγ2: silencing PLCB2 or PLCG2 genes alters the expression of the other counterpart. A functional link between these two isoforms has never been described for OS. Supporting this observation, we also found a correlation between PLCβ2 and PLCγ2 expression in public osteosarcoma datasets (GDC TARGET-OS). Silencing of PLCβ2 and PLCγ2 enhanced cell proliferation compared to scrambled controls and accelerated wound closure. These early findings were confirmed by Boyden chamber invasion assays, where PLCγ2 silencing increased the migratory potential of OS cells relative to both scrambled and untreated controls. Next generation sequencing data further revealed that PLCβ2/PLCγ2 silenced cells displayed a marked upregulation of adhesion molecules and migration-related genes. Altered expression of focal adhesion complex proteins was also validated by immunofluorescence and western blot analyses. Interestingly, these changes suggest that OS cells modify their perception of the extracellular environment by activating the YAP signaling pathway, which appears particularly enhanced following PLCγ2 silencing. Overall, our data show that PLCβ2/PLCγ2 modulation strongly influence OS cell proliferation and migration mechanism. PLC-dependent pathways may contribute to the aggressive phenotype of OS, representing a promising framework to better understand cancer cell dissemination, one of the main causes of poor survival for OS patients.

Osteosarcoma (OS) è un raro e aggressivo tumore primario del tessuto osseo, che colpisce prevalentemente bambini e adolescenti. Viene spesso diagnosticato in stadi avanzati, la mortalità legata a questa patologia è elevata e la prognosi è resa particolarmente sfavorevole dalla frequente presenza di metastasi al momento della diagnosi. I meccanismi molecolari che determinano la progressione dell’OS restano ancora poco chiari. Tuttavia, la letteratura recente indica la via dei fosfoinositidi, e le diverse isoforme degli enzimi fosfolipasi C (PLC) che ne fanno parte, come coinvolte nei processi che determinano la progressione tumorale. Con questo studio si è cercato di esplorare come la modulazione delle isoforme degli enzimi PLC influenzi la crescita, la sopravvivenza e la motilità delle cellule di OS. In particolare, tale modulazione è avvenuta attraverso l’inibizione farmacologica e silenziamento di diverse isoforme delle PLC. I nostri risultati mostrano come l’inibitore delle PLC U73122 riduca significativamente il tasso di crescita cellulare di OS rispetto alle cellule non trattate e a quelle trattate con l’analogo inattivo. Da questo studio è inoltre emersa l’esistenza di una possibile interazione tra le isoforme PLCβ2 e PLCγ2: in particolare il silenziamento di una delle due isoforme altera a livello genico e proteico l’espressione dell’altra. Un legame funzionale tra queste due isoforme non era mai stato descritto in letteratura in questo contesto tumorale. A supporto di questa osservazione sperimentale, un’analisi effettuata in-silico utilizzando dataset pubblici di gene expression relativi a pazienti affetti da OS (GDC TARGET-OS), ha confermato l’esistenza di una correlazione tra l’espressione genica delle isoforme PLCβ2 e PLCγ2. Il silenziamento di PLCβ2 e PLCγ2 determina un aumento della proliferazione cellulare rispetto ai controlli (trattamento con siRNA scramble e non trattato) e determina una maggiore motilità cellulare che si concretizza nell’accelerazione la chiusura dello scratch osservata nei saggi di wound healing. Queste prime osservazioni sono state confermate anche da saggi di invasione utilizzando camere di Boyden ricoperte di Matrigel®. Si è osservato che il silenziamento di PLCγ2 incrementa la capacità migratoria delle cellule di OS rispetto controlli (trattamento con siRNA scramble e non trattato). Le analisi di gene expression profiling (utilizzando la tecnologia di Next Generation Sequencing Illumina) hanno inoltre rivelato che le cellule silenziate per PLCβ2/PLCγ2 presentano una marcata upregolazione di gene set legati all’adesione cellulare e ai processi di migrazione. Le alterazioni nell’espressione delle proteine del focal adhesion complex sono state confermate da analisi di immunofluorescenza e western blot. È interessante notare come tali alterazioni nei meccanismi di adesione e migrazione si ripercuotano anche sui meccanismi di mechano-sensing e meccanotrasduzione: la via di segnalazione di YAP in particolare risulta particolarmente attiva in seguito al silenziamento di PLCγ2. Complessivamente i nostri dati suggeriscono che la modulazione di PLCβ2 e PLCγ2 influenzi in modo significativo la proliferazione e la migrazione delle cellule 143b di osteosarcoma umano. Una de-regolazione del signaling delle PLC potrebbe contribuire allo sviluppo di un fenotipo particolarmente aggressivo di OS. Dunque comprendere il ruolo che rivestono alcune isoforme degli enzimi PLC in OS potrebbe aiutare a comprendere meglio i meccanismi di disseminazione e metastatizzazione del tumore, che rappresentano una delle principali cause della diminuzione del tasso di sopravvivenza dei pazienti affetti da questa patologia.