Una Strategia Innovativa di Terapia Genica basata su cellule CAR T con anticorpo a dominio singolo dirette contro HER2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule: dallo sviluppo alla validazione funzionale.

HER2-altered non–small cell lung cancer (NSCLC) comprises a biologically heterogeneous spectrum, including activating mutations, gene amplification, and variable levels of protein expression, for which effective therapeutic options remain limited. Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy represents a promising strategy; however, its application in solid tumors is constrained by antigen heterogeneity, the immunosuppressive tumor microenvironment, and concerns related to on-target/off-tumor toxicity. In this context, optimization of the antigen-binding domain may critically influence CAR T-cell specificity, activation, and safety. Single-domain antibodies (sdAbs, VHHs), owing to their reduced size and favorable structural properties, may provide functional advantages over conventional single-chain variable fragments (scFvs) as CAR antigen-binding domains. In this study, we developed and functionally characterized sdAb-based CAR T cells targeting HER2 in NSCLC. Two HER2-specific sdAbs with distinct binding profiles were selected and incorporated into second-generation CAR constructs, enabling direct comparison of CAR performance as a function of antigen-binding properties. A clinically validated scFv-based anti-HER2 CAR was used as a control. sdAb-based CARs exhibited robust antigen-dependent activation while displaying significantly reduced basal (tonic) signalling compared with the scFv-based CAR. In vitro cytotoxicity assays demonstrated comparable killing activity across all CAR constructs in HER2-high NSCLC models. In contrast, under HER2-low conditions, higher-affinity sdAb-based CAR T cells showed superior cytotoxic activity and increased cytokine production relative to lower-affinity sdAb- and scFv-based CARs. Importantly, in vivo evaluation in a HER2-low NSCLC xenograft model confirmed the antitumor efficacy of the higher-affinity sdAb-based CAR T cells. Collectively, these findings provide preclinical evidence supporting the feasibility of sdAb-based CAR T-cell strategies in HER2-heterogeneous NSCLC and underscore the role of antigen-binding properties as key determinants of CAR T-cell activation and function, warranting further investigation in advanced preclinical models.

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) con alterazioni di HER2 comprende uno spettro biologicamente eterogeneo, che include mutazioni attivanti, amplificazione genica e livelli variabili di espressione proteica, per i quali le opzioni terapeutiche efficaci rimangono limitate. La terapia con cellule T ingegnerizzate con recettore chimerico per l’antigene (CAR T) rappresenta una strategia promettente; tuttavia, la sua applicazione nei tumori solidi è limitata dall’eterogeneità antigenica, dal microambiente tumorale immunosoppressivo e dalle problematiche legate alla tossicità on-target/off-tumor. In questo contesto, l’ottimizzazione del dominio di legame con l’antigene potrebbe influenzare in maniera critica la specificità, l’attivazione e la sicurezza delle cellule CAR T. Gli anticorpi a dominio singolo (sdAb, VHH), grazie alle loro dimensioni ridotte e alle favorevoli proprietà strutturali, potrebbero offrire vantaggi funzionali rispetto ai convenzionali frammenti variabili a catena singola (scFv) come domini di legame antigenico dei CAR. In questo studio abbiamo sviluppato e caratterizzato funzionalmente cellule CAR T basate su sdAb dirette contro HER2 nel NSCLC. Due sdAb specifici per HER2, caratterizzati da differenti profili di legame, sono stati selezionati e incorporati in costrutti CAR di seconda generazione, consentendo un confronto diretto delle prestazioni dei CAR in funzione delle proprietà di legame con l’antigene. Come controllo è stato utilizzato un CAR anti-HER2 basato su scFv già validato clinicamente. I CAR basati su sdAb hanno mostrato una robusta attivazione antigene-dipendente, presentando al contempo una riduzione significativa del signalling basale (tonic signalling) rispetto al CAR basato su scFv. I saggi di citotossicità in vitro hanno dimostrato un’attività di uccisione comparabile tra tutti i costrutti CAR nei modelli di NSCLC ad alta espressione di HER2. Al contrario, in condizioni di bassa espressione di HER2, le cellule CAR T basate su sdAb ad alta affinità hanno mostrato una superiore attività citotossica e una maggiore produzione di citochine rispetto ai CAR basati su sdAb a minore affinità e ai CAR basati su scFv. È importante sottolineare che la valutazione in vivo in un modello xenotrapiantato di NSCLC HER2-low ha confermato l’efficacia antitumorale delle cellule CAR T basate su sdAb ad alta affinità. Nel complesso, questi risultati forniscono evidenze precliniche a supporto della fattibilità di strategie CAR T basate su sdAb nel NSCLC eterogeneo per HER2 e sottolineano il ruolo delle proprietà di legame con l’antigene quali determinanti chiave dell’attivazione e della funzione delle cellule CAR T, giustificando ulteriori indagini in modelli preclinici avanzati.