Esplorare la biodiversità e l'ecologia dei tardigradi italiani in ambienti terrestri: tra tassonomia integrata e DNA metabarcoding

Tardigrades are microscopic, aquatic invertebrates inhabiting every biome on Earth. The distribution and abundance of tardigrade species are influenced by abiotic and biotic factors; however, our understanding remains limited. In terrestrial environments, most studies on tardigrade biodiversity have traditionally focused on mosses and lichens. In contrast, other habitats, such as leaf litter, have received less attention. Integrative taxonomy has long been the traditional method for studying tardigrade biodiversity; however, it is labour-intensive, time-consuming, and requires taxonomic expertise. In this context, DNA metabarcoding offers a powerful alternative, providing a cost-effective and high-throughput approach to biodiversity assessment that can complement some of the limitations of traditional methods. Within this PhD thesis, the performance of COI and 18S DNA metabarcoding primer pairs from literature was tested in silico. Most of these existing primer pairs showed insufficient performance (<70%) in terms of coverage and taxonomic resolution. Therefore, three new primer pairs were designed: two for the 18S gene (one for each class, Eutardigrada and Heterotardigrada) and one ITS2 primer pair specific to Heterotardigrada. As only eutardigrades are typically found in leaf litter of Southern Europe, the Eutar_18S primer was experimentally tested, showing higher amplification efficiency and better taxonomic resolution than a commonly used soil biodiversity primer. More than thirty leaf litter samples were collected from the Foreste Casentinesi National Park, belonging to three different types of leaf litter. Nine of these samples were analysed using both integrated taxonomy and DNA metabarcoding, confirming comparable results between the two approaches. The integrative taxonomy allowed the identification of more than fifteen different species. So far, five of them are new to science. Taxonomic assignment of the obtained 18S ASVs (Amplicon Sequence Variant) from DNA metabarcoding (18S) was performed using both a public reference library and the curated one. The latter provided a higher ASVs coverage of that could not previously be assigned at the genus level. The analyses showed that tardigrade biodiversity differs significantly among forest types, both in terms of the number of taxa and their relative abundances. The leaf litter showing the highest species richness is the mixed one, likely due to the presence of different microclimates. In particular, the genera Dianea, Ursulinius, and Pilatobius are predominant in this litter type, whereas in the beech litter the most represented genus is Dianea. Less frequent genera across all three litter types include Adropion, Astatumen, Diphascon, Hypsibius, Parahypsibius, and Milnesium. Moreover, population dynamics analyses of tardigrades in beech leaf litter using DNA metabarcoding are still ongoing. In conclusion, DNA metabarcoding represents a powerful tool for assessing and monitoring tardigrade biodiversity; however, its effectiveness strongly depends on primer selection and the quality of reference libraries. These findings emphasize that DNA metabarcoding should complement, rather than replace, integrative taxonomy. The high tardigrade diversity observed in leaf litter, consistent with previous studies, further highlights the ecological importance of this habitat. Overall, this PhD thesis contributes to advancing our understanding of several understudied aspects of tardigrade biology and ecology in leaf litter.

I tardigradi sono micrometazoi acquatici che occupano quasi ogni habitat della Terra. La distribuzione e l’abbondanza delle specie sono influenzate da fattori abiotici e biotici; tuttavia, la comprensione su tali temi rimane limitata. Negli ambienti terrestri, la maggior parte degli studi sulla biodiversità dei tardigradi si è concentrata su muschi e licheni, mentre altri ambienti, come la lettiera di foglie, hanno ricevuto meno attenzione. L’approccio divenuto tradizionale allo studio della biodiversità dei tardigradi è la tassonomia integrata; tuttavia, è dispendiosa in termini di tempo, e richiede esperienza tassonomica. In questo contesto, il DNA metabarcoding è un approccio economico e ad alta efficienza, e potenzialmente capace di integrare e superare alcune delle limitazioni dei metodi tradizionali. Nella presente tesi di dottorato, le performance di coppie di primer per i geni 18S e COI per DNA metabarcoding della letteratura sono state testate in silico evidenziando che la maggior parte presenta prestazioni insufficienti (<70%) in termini di copertura e risoluzione tassonomica. Pertanto, sono state progettate due coppie di primer per il gene 18S (una per ciascuna classe, Eutardigrada e Heterotardigrada) e una coppia per il gene ITS2 per Heterotardigrada. Poiché nella lettiera di foglie dell’Europa meridionale, si rinvengono prevalentemente eutardigradi, il nuovo primer Eutar_18S è stato selezionato per i test sperimentali, mostrando un’efficienza di amplificazione e una risoluzione tassonomica superiori rispetto ad un primer comunemente usato per la biodiversità del suolo. Sono stati raccolti più di trenta campioni appartenenti a tre diverse tipologie di lettiera di foglie nel Parco Nazionale delle Foreste Casentinesi. Nove di questi campioni sono stati analizzati sia mediante tassonomia integrata che DNA metabarcoding, confermando risultati comparabili tra i due approcci. La tassonomia integrata ha permesso di identificare oltre quindici specie, cinque delle quali sono nuove per la scienza. L’assegnazione tassonomica degli ASV (Amplicon Sequence Variant) derivanti dal DNA metabarcoding (18S), effettuata sia su librerie pubbliche che su quelle curate, ha permesso di aumentare il numero di ASV identificati a livello di genere. Le analisi hanno evidenziato che la biodiversità dei tardigradi differisce significativamente tra i diversi tipi di lettiera, sia in termini di numero di taxa sia di abbondanza relativa. La lettiera che presenta la maggiore ricchezza di specie è quella mista, grazie alla presenza di microclimi differenti. In particolare, in questa tipologia di lettiera risultano prevalenti i generi Dianea, Ursulinius e Pilatobius, mentre nella lettiera di faggio il genere più rappresentato è Dianea. Generi meno frequenti in tutte e tre le tipologie di lettiera includono Adropion, Astatumen, Diphascon, Hypsibius, Parahypsibius e Milnesium. Attualmente sono in fase conclusiva le analisi sulla dinamica di popolazione dei tardigradi nella lettiera di faggio, effettuate mediante DNA metabarcoding. In conclusione, il DNA metabarcoding si è dimostrato uno strumento potente anche per monitorare la biodiversità dei tardigradi; tuttavia, la sua efficacia dipende dalla scelta dei primer e dalla qualità delle librerie di riferimento. Questi risultati evidenziano come il DNA metabarcoding debba essere considerato un approccio complementare e non sostitutivo della tassonomia integrata. L’elevata biodiversità di tardigradi osservata nella lettiera di foglie, in accordo con studi precedenti, sottolinea ulteriormente l’importanza ecologica di questo habitat. Questo elaborato di tesi contribuisce ad ampliare la conoscenza di diversi aspetti ancora poco esplorati della biologia e dell’ecologia dei tardigradi nella lettiera di foglie.