Biotecnologie e Genomica Funzionale per il Miglioramento Genetico di Cannabis sativa L.: dai Sistemi In vitro alla Mutagenesi per la Validazione Funzionale dei Geni

Cannabis sativa L., a species of major medical and industrial interest, exhibits strong recalcitrance to in vitro regeneration, hindering the application of advanced genetic improvement and molecular engineering techniques. This work developed innovative approaches in plant biotechnology and functional genomics aimed at overcoming these barriers and elucidating the molecular mechanisms underlying phytocannabinoid biosynthesis and glandular trichome formation. The study optimized micropropagation and tissue culture protocols in Cannabis sativa, establishing new culture media and hormonal combinations to enhance explant multiplication, rooting, and stability. A novel medium (PP medium) was develpped, now under patent, significantly improved explant performance compared with standard substrates. Other experiments investigated direct regeneration of asexual explants, transient gene expression through β-glucuronidase agroinfiltration, and molecular protocols for Hop latent viroid (HLVd) detection. A study was developed on a TILLING population generated through ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenesis from a cross between the high-CBD “Elite” genotype and the EU-certified cultivar ‘Finola’. Genotyping focused on key genes involved in phytocannabinoid metabolism and epidermal morphogenesis, including Olivetolic Acid Synthase (OLS), Prenyl Transferase 4 (PT4), and a MYB transcription factor, using allele-specific PCR, PACE assays, and Sanger sequencing. Phenotypic characterization under controlled conditions combined HPLC-based cannabinoid profiling with stereomicroscopic and digital analysis of trichome density and morphology. Statistical analysis revealed significant correlations between genotypic profiles, trichome morphology, and cannabinoid content, suggesting a regulatory role of MYB in epidermal differentiation and secondary metabolic modulation. Mutations in OLS and PT4 showed minor or background-dependent effects, highlighting the complexity of interactions controlling phytochemical biosynthesis. Overall, this research established biotechnological tools and genetic resources for the functional analysis of Cannabis sativa, providing a methodological framework for the validation of regulatory genes involved in trichome development and cannabinoid biosynthesis. These findings open new avenues for advanced breeding and molecular improvement strategies in this species of high therapeutic relevance.

La Cannabis sativa L., specie di elevato interesse medico e industriale, è caratterizzata da una forte recalcitranza alla rigenerazione in vitro, che limita l’applicazione di tecniche avanzate di miglioramento genetico e di ingegneria molecolare. Il presente lavoro ha sviluppato approcci innovativi di biotecnologie vegetali e genomica funzionale, con l’obiettivo di superare tali barriere e approfondire i meccanismi molecolari alla base della biosintesi dei fitocannabinoidi e della formazione dei tricomi ghiandolari. L’attività ha previsto l’ottimizzazione dei protocolli di micropropagazione e coltura dei tessuti in C. sativa, con la messa a punto di nuovi mezzi nutritivi e combinazioni ormonali per migliorare la moltiplicazione, la radicazione e la stabilità degli espianti. La formulazione di un nuovo terreno di coltura (PP medium), in via di brevettazione, ha consentito di ottenere espianti di maggiore qualità rispetto ai mezzi convenzionali. Parallelamente, sono stati condotti studi sulla rigenerazione diretta di espianti gamici e agamici, sull’espressione genica transiente tramite agroinfiltrazione di costrutti β-glucuronidasici, e su protocolli molecolari per la diagnosi di Hop latent viroid (HLVd). Nell’ambito della genomica funzionale, è stato effettuato uno studio su una popolazione TILLING indotta con etilmetansulfonato (EMS), derivata dall’incrocio tra un genotipo ad alto contenuto di CBD (“Elite”) e la cultivar europea ‘Finola’. Le analisi di genotipizzazione hanno interessato geni chiave implicati nella biosintesi dei fitocannabinoidi e nella morfogenesi epidermica, tra cui Olivetolic Acid Synthase (OLS), Prenyl Transferase 4 (PT4) e un fattore di trascrizione MYB, attraverso PCR allele-specifica, saggio PACE e sequenziamento Sanger. Le linee mutagenizzate sono state caratterizzate per il contenuto in fitocannabinoidi mediante HPLC e per la densità e tipologia dei tricomi con microscopia stereoscopica e analisi digitale. L’analisi statistica ha evidenziato una correlazione significativa tra il profilo genotipico, la morfologia dei tricomi e il contenuto in cannabinoidi, suggerendo un ruolo regolatorio del fattore MYB nella differenziazione epidermica e nella modulazione dei flussi metabolici secondari. Le mutazioni nei geni OLS e PT4 hanno mostrato effetti minori o dipendenti dal background genetico, confermando la complessità delle interazioni che governano la biosintesi del fitocomplesso. Nel complesso, il lavoro ha portato alla definizione di strumenti biotecnologici e risorse genetiche per l’analisi funzionale in C. sativa, fornendo una base metodologica per la validazione di geni regolatori coinvolti nella formazione dei tricomi e nella biosintesi dei cannabinoidi. Tali risultati aprono nuove prospettive per l’applicazione di strategie di miglioramento genetico e di selezione mirata in questa specie di rilevante valore terapeutico.