Soluzioni Enzimatiche per la Valorizzazione dei Rifiuti: Approfondimenti Strutturali e Funzionali su Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) e PET Idrolasi

The increasing demand for sustainable biocatalysts capable of valorizing waste materials has stimulated intense research into oxidative and hydrolytic enzymes. In this doctoral work, two emerging classes of enzymes were investigated: lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and polyethylene terephthalate hydrolases (PETases). LPMOs are copper-dependent metalloenzymes that have recently emerged as pivotal players in the oxidative degradation of recalcitrant polysaccharides. Here, three bacterial AA10 LPMOs (PpAA10 from Pseudomonas putida, ScAA10B and ScAA10C from Streptomyces coelicolor) were heterologously produced in Escherichia coli and characterized regarding their substrate specificity, stability, and kinetic parameters. A combination of spectroscopic (ATR-FTIR) and electrochemical (amperometric) assays was employed to monitor their activity under both monooxygenase and peroxygenase conditions. This enabled the determination of turnover numbers (TN) and total turnover numbers (TTN) on diverse substrates and conditions, providing valuable insights into the effect of substrate crystallinity, hydrogen peroxide availability and the presence of carbohydrate-binding modules (CBM), on enzyme performance and oxidative stability. Furthermore, the X-ray structure of PpAA10 was solved, offering a structural basis to better understand the activity behaviour of LPMOs. In parallel, this study focused on PETases, a novel class of plastic-degrading enzymes with strong potential in plastic bioremediation and circular economy applications. A PETase-like enzyme from Streptomyces sp. SM14 (PETase SM14) was heterologously expressed in Escherichia coli and its structure solved through X-ray crystallography, revealing conserved features of the PETase family together with the unique properties of salt tolerance. Analytical assays combined with substrate surface analyses (SEM and AFM) highlighted its ability to degrade post-consumer plastics under challenging conditions. Molecular dynamics simulations further elucidated the structural and functional differences between PETase SM14 and Ideonella sakaiensis PETase (IsPETase), especially in response to the ionic strength, thus providing guidelines for future protein engineering. Finally, a novel approach exploiting Chlamydomonas reinhardtii chloroplast transformation enabled the sustainable production of IsPETase, demonstrating the potentiality of using microalgal platforms for bioplastic-degrading enzymes production. This work provides novel biochemical, structural and kinetic insights into LPMOs and PETases. The results contribute to the broader vision of harnessing natural biocatalysts for the sustainable conversion of waste biomass and plastic materials into value-added products, supporting the development of innovative bio-based technologies for circular economy.

La crescente domanda di biocatalizzatori sostenibili in grado di valorizzare i materiali di scarto ha stimolato un'intensa ricerca sugli enzimi ossidativi e idrolitici. In questo lavoro di dottorato sono state studiate due classi emergenti di enzimi: le lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) e le idrolasi del polietilene tereftalato (PETasi). Le LPMOs sono metalloenzimi rame-dipendenti recentemente emersi come attori fondamentali nella degradazione ossidativa dei polisaccaridi recalcitranti. In questo studio, tre LPMOs batteriche della famiglia AA10 (PpAA10 da Pseudomonas putida, ScAA10B e ScAA10C da Streptomyces coelicolor) sono state prodotte in modo eterologo in Escherichia coli e caratterizzate in termini di specificità del substrato, stabilità e cinetica enzimatica. È stata impiegata una combinazione di analisi spettroscopiche (ATR-FTIR) ed elettrochimiche (amperometriche) per monitorare la loro attività sia in condizioni monossigenasiche che perossigenasiche. Ciò ha consentito la determinazione dei numeri di turnover (TN) e dei numeri di turnover totali (TTN) su diversi substrati e condizioni, fornendo preziose informazioni sull'effetto della cristallinità del substrato, della disponibilità di perossido di idrogeno e della presenza del carbohydrate-binding module (CBM), sulle prestazioni enzimatiche e sulla stabilità ossidativa. Inoltre, è stata risolta la struttura a raggi X della PpAA10, offrendo una base strutturale per comprendere meglio il comportamento dell'attività delle LPMOs. Parallelamente, questo studio si è concentrato sulle PETase, una nuova classe di enzimi che degradano la plastica con un forte potenziale in applicazioni di biorisanamento della plastica e di economia circolare. La PETasi da Streptomyces sp. SM14 (PETasi SM14) è stata espressa in modo eterologo in Escherichia coli e la sua struttura è stata risolta mediante cristallografia a raggi X, rivelando caratteristiche conservate della famiglia delle PETasi, insieme alla proprietà unica della tolleranza al sale. I test analitici combinati con le analisi della superficie del substrato (SEM e AFM) hanno evidenziato la sua capacità di degradare la plastica post-consumo in condizioni complesse. Le simulazioni di dinamica molecolare hanno ulteriormente chiarito le differenze strutturali e funzionali tra la PETasi SM14 e la PETasi da Ideonella sakaiensis (IsPETasi), soprattutto in risposta alla forza ionica, fornendo così linee guida per future applicazioni di ingegneria molecolare. Infine, un nuovo approccio che sfrutta la trasformazione dei cloroplasti di Chlamydomonas reinhardtii ha consentito la produzione sostenibile di IsPETasi, dimostrando la potenzialità dell’utilizzo delle microalghe per la produzione di enzimi che degradano la plastica. Questo lavoro fornisce nuove informazioni biochimiche, strutturali e cinetiche sulle LPMOs e sulle PETase. I risultati contribuiscono alla visione più ampia di sfruttare i biocatalizzatori naturali per la conversione sostenibile della biomassa di scarto e dei materiali plastici in prodotti ad alto valore aggiunto, sostenendo lo sviluppo di tecnologie innovative biotecnologiche per l’economia circolare.