Tolleranza allo stress e risposte adattative durante la fermentazione alcolica: studio comparativo tra lieviti enologici Saccharomyces e non-Saccharomyces

During alcoholic fermentation, wine yeasts encounter multiple environmental stresses that trigger complex adaptive responses. The plasma membrane undergoes significant remodeling through modulation of lipid composition and gene expression to maintain functionality. These stress-induced alterations directly influence fermentation kinetics, sugar consumption, and metabolite production that determine wine quality. While stress responses in Saccharomyces cerevisiae have been extensively characterized, our understanding of these processes in non-Saccharomyces species such as Torulaspora delbrueckii and Metschnikowia pulcherrima remains limited, despite their increasing use for enhancing wine complexity. The aim of this PhD thesis was to investigate stress tolerance and membrane adaptation mechanisms in wine yeast strains during alcoholic fermentation, focusing on ethanol and temperature stress responses, and evaluate fermentation optimization strategies. Yeast strains from the Unimore Microbial Culture Collection (UMCC) belonging to S. cerevisiae, T. delbrueckii, and M. pulcherrima species were studied for their stress response capabilities. The research employed a multi-stage approach beginning with evaluation of ethanol tolerance and fermentative capacity in different strains. Membrane fluidity analyses revealed that strains with higher ethanol tolerance and superior fermentative performance exhibited increased membrane fluidity at 10% v/v ethanol. In contrast, less tolerant strains, particularly non-Saccharomyces strains, showed smaller increases in fluidity. Cell surface morphology analysis under high ethanol stress (18% v/v) revealed that sensitive strains displayed elevated surface roughness values, indicating membrane instability, while the more tolerant ones exhibited lower roughness values, indicative of enhanced cellular adaptability. These strain-specific adaptive responses were further investigated through gene expression analysis of key genes involved in membrane lipid metabolism, integrated with lipid profiling including fatty acid and sterol composition. Beyond ethanol stress, temperature effects were examined during yeast rehydration under suboptimal industrial conditions, analyzing the impact on membrane fluidity and fermentative performance, with rehydration nutrients evaluated for their protective effects against temperature-induced membrane stiffening. Additionally, various oenological additives were tested to assess their impact on strain-specific fermentative performance, including analysis of fermentation dynamics, sugar consumption, and metabolite production. This work provides fundamental insights into stress tolerance mechanisms in wine yeasts through comprehensive characterization of strain-specific responses, establishing a knowledge base that supports the rational selection of resilient strains and the development of optimized fermentation strategies for oenological applications.

Durante la fermentazione alcolica, i lieviti enologici sono sottoposti a molteplici stress ambientali che innescano complesse risposte adattative. La membrana plasmatica subisce un rimodellamento significativo attraverso la modulazione della composizione lipidica e dell'espressione genica per mantenere la propria funzionalità. Tali alterazioni indotte da stress influenzano direttamente la cinetica fermentativa, il consumo degli zuccheri e la produzione di metaboliti che determinano la qualità del vino. Mentre le risposte allo stress in Saccharomyces cerevisiae sono state ampiamente caratterizzate, la comprensione di questi processi in specie non-Saccharomyces quali Torulaspora delbrueckii e Metschnikowia pulcherrima rimane limitata, nonostante il loro crescente impiego per incrementare la complessità del vino. L'obiettivo di questa tesi di dottorato è stato investigare i meccanismi di tolleranza allo stress e di adattamento della membrana in ceppi di lievito di interesse enologico durante la fermentazione alcolica, con particolare attenzione alle risposte allo stress da etanolo e temperatura, e valutare strategie per l'ottimizzazione del processo fermentativo. Sono stati analizzati ceppi di lievito provenienti dalla Unimore Microbial Culture Collection (UMCC) appartenenti alle specie S. cerevisiae, T. delbrueckii e M. pulcherrima, caratterizzandone le capacità di risposta allo stress. La ricerca ha adottato un approccio multifasico, partendo dalla valutazione della tolleranza all'etanolo e delle capacità fermentative dei diversi ceppi. Le analisi di fluidità di membrana hanno rivelato che i ceppi con maggiore tolleranza all'etanolo e prestazioni fermentative superiori presentavano maggiore fluidità di membrana al 10% v/v di etanolo. Al contrario, i ceppi meno tolleranti, in particolare i ceppi non-Saccharomyces, hanno mostrato incrementi minori della fluidità. L'analisi morfologica della superficie cellulare in condizioni di elevato stress da etanolo (18% v/v) ha evidenziato che i ceppi sensibili presentavano valori elevati di rugosità superficiale, indice di instabilità di membrana, mentre quelli più tolleranti mostravano valori di rugosità inferiori, indicativi di una maggiore adattabilità cellulare. Queste risposte adattative ceppo-specifiche sono state ulteriormente investigate mediante analisi dell'espressione di geni chiave del metabolismo lipidico di membrana, integrata con analisi del profilo lipidico, inclusa la composizione in acidi grassi e steroli. Oltre allo stress da etanolo, sono stati esaminati gli effetti della temperatura durante la reidratazione dei lieviti in condizioni industriali subottimali, analizzandone l'impatto sulla fluidità di membrana e sulle prestazioni fermentative. Sono stati valutati i nutrienti di reidratazione per il loro effetto protettivo contro l'irrigidimento della membrana indotto dalla temperatura. Parallelamente, sono stati testati diversi additivi enologici per determinarne gli effetti sulle prestazioni fermentative ceppo-specifiche, analizzando la dinamica di fermentazione, l'utilizzo degli zuccheri e la produzione di metaboliti. Questo lavoro fornisce conoscenze fondamentali sui meccanismi di tolleranza allo stress nei lieviti di interesse enologico attraverso una caratterizzazione completa delle risposte ceppo-specifiche, stabilendo così una base scientifica per la selezione razionale di ceppi resilienti e lo sviluppo di strategie fermentative ottimizzate in ambito enologico.