Ruolo della proteasi mitocondriale Lonp1 nella regolazione della mitofagia

Lonp1 is a mitochondrial protease encoded by nuclear DNA essential for organelle homeostasis and cell response to stress. Lonp1 is induced by several stress stimuli, such as hypoxia, heat shock, ER and oxidative stress, ischemic preconditioning, nutrient depletion, and unfolded protein response. For this reason, Lonp1 could promote cancer cell survival favouring cell resistance to stress. Our group has previously shown that Lonp1 is upregulated in colorectal cancer, compared to the normal mucosal counterparts, and that Lonp1 increases during colon cancer progression. As we observed that Lonp1 selectively degrades PINK1, and since it is known that HIF1-a enhances Lonp1 expression, we investigated the possible role of Lonp1 in regulating mitophagy, under normoxic and hypoxic conditions. Silencing of Lonp1 increases PINK1 levels and localization of PINK1 on mitochondrial membrane in the presence of CCCP, a well-known mitophagy inducer, while overexpression has the opposite effect; no changes were observed in other mitophagic pathways such as ULK1 and FUNDC1. Hypoxia does not alter these effects, but we observed that Lonp1 overexpression causes a reduction of HIF-1 levels under hypoxia. The absence of Lonp1 and the induction of mitophagy by CCCP causes a complex alteration of mitochondrial dynamics proteins, increase in reactive oxygen species (ROS) levels and mitochondrial membrane potential reduction, and mitochondrial morphology impairment. While investigating Lonp1 modulation in mitophagy, we observed that Lonp1 is present in the nucleus, and not only in the mitochondria, and that nuclear levels increase in response to heat shock, but not to DNA damage or cell cycle arrest. When in the nucleus, Lonp1 interacts with Heat Shock Factor 1 (HSF1) and mitigates HSF1-mediated response. Thus, Lonp1 may be part of a regulatory mechanism with nucleus-mitochondria crosstalk in response to stress. Finally, we showed three different isoforms of Lonp1 co-exist, that we named ISO1, the full-length isoform and the most abundant one; ISO2, slightly shorter at the N-domain and ISO3, the shortest one, without the mitochondrial targeting sequence (MTS). We inspected TSVdb, a database of splicing isoforms of human genes in normal and transformed cells and found that these three isoforms are differentially expressed in different tissues, and comparing normal and tumoral tissue, we can find an upregulation of the isoforms in tumor, except for ISO3. These three isoforms have different subcellular localization, as ISO1 is almost exclusively mitochondrial, ISO2 is present both in mitochondria and in the cytosol, while ISO3 does not colocalize with mitochondria, in agreement with the absence of MTS. Interestingly, ISO1 and ISO2 are differently modulated in cancer, being ISO2 the form that is upregulated more frequently and at higher levels. The overexpression of the three isoforms impacts mitochondrial respiration by increasing it, comparing to control, and modulates tumour aggressiveness. In conclusion, our study highlighted the involvement of Lonp1 in the regulation of mitophagy, also in a hypoxic environment. In particular, we showed modification in mitophagic pathways activation, mitochondrial turnover and morphology, and ROS production when Lonp1 is silenced or upregulated. Moreover, our study revealed that Lonp1 may be part of a regulatory mechanism with nucleus-mitochondria crosstalk in response to shock, and that Lonp1 also exists in extramitochondrial form, mainly due to different isoforms by alternative splicing. The relative expression of either form impacts mitochondrial respiration and metabolism. These observations greatly expand the list of roles and functions of Lonp1, which go far beyond those attributed to this protein so far.

Lonp1 è una proteasi mitocondriale essenziale per l'omeostasi degli organelli e la risposta delle cellule allo stress. Lonp1 è indotta da diversi stimoli di stress, come l'ipossia, lo shock termico, lo stress ossidativo, il precondizionamento ischemico e la deplezione di nutrienti. Per questo motivo, Lonp1 potrebbe promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali favorendo la resistenza delle cellule allo stress. Il nostro gruppo ha in precedenza dimostrato che Lonp1 è upregolato nel cancro del colon-retto, rispetto alla mucosa normale, e che Lonp1 aumenta durante la progressione del cancro del colon. Poiché abbiamo osservato che Lonp1 degrada selettivamente PINK1 e poiché è noto che HIF1- aumenta l'espressione di Lonp1, abbiamo studiato il possibile ruolo di Lonp1 nella regolazione della mitofagia, in condizioni di normossia e ipossia. Il silenziamento di Lonp1 aumenta i livelli di PINK1 e la sua localizzazione sulla membrana mitocondriale in presenza di CCCP, un noto induttore di mitofagia, mentre l’overespressione ha l'effetto opposto; non sono stati osservati cambiamenti in altre vie mitofagiche come ULK1 e FUNDC1. L'ipossia non altera questi effetti, ma abbiamo osservato che l’overespressione di Lonp1 modula i livelli di HIF-1 in condizioni di ipossia. L'assenza di Lonp1 e l'induzione della mitofagia da parte di CCCP causano una complessa alterazione delle proteine della dinamica mitocondriale, l'aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la riduzione del potenziale di membrana mitocondriale e la compromissione della morfologia mitocondriale. Studiando il ruolo di Lonp1 nella mitofagia, abbiamo osservato che Lonp1 è presente nel nucleo, e non solo nei mitocondri, e che i livelli nucleari aumentano in risposta allo shock termico. Quando nel nucleo, Lonp1 interagisce con il fattore di shock termico 1 (HSF1) e attenua la risposta HSF1-mediata. Infine, abbiamo dimostrato la coesistenza di tre diverse isoforme di Lonp1, che abbiamo chiamato ISO1, l'isoforma completa e la più abbondante; ISO2, più corta nel dominio N-terminale e ISO3, la più corta, senza la sequenza di targeting mitocondriale (MTS). Esaminando TSVdb, un database di isoforme di splicing di geni umani abbiamo osservato che queste tre isoforme sono espresse in modo differente in diversi tessuti e che c’è un'upregolazione delle isoforme nei tumori. Queste isoforme hanno una diversa localizzazione subcellulare, ISO1 è quasi esclusivamente mitocondriale, ISO2 è presente sia nei mitocondri che nel citosol, mentre ISO3 non colocalizza con i mitocondri, in accordo con l'assenza di MTS. ISO1 e ISO2 sono modulati in modo diverso nel cancro, essendo ISO2 la forma che viene upregolata più frequentemente e a livelli più elevati. L’overespressione delle isoforme ha inoltre un impatto sulla respirazione mitocondriale, aumentandola rispetto al controllo, e modula l'aggressività del tumore. In conclusione, il nostro studio ha evidenziato il coinvolgimento di Lonp1 nella regolazione della mitofagia, anche in ambiente ipossico. In particolare, abbiamo osservato modifiche nell'attivazione delle vie mitofagiche, nel turnover e nella morfologia mitocondriale e nella produzione di ROS quando Lonp1 è silenziato o upregolato. Inoltre, il nostro studio ha rivelato che Lonp1 può far parte di un meccanismo di regolazione con scambio nucleo-mitocondri in risposta allo shock e che Lonp1 esiste anche in forma extramitocondriale, principalmente a causa di diverse isoforme da splicing alternativo. L'espressione relativa delle isoforme influisce sulla respirazione e sul metabolismo mitocondriale. Queste osservazioni ampliano notevolmente l'elenco dei ruoli e delle funzioni di Lonp1, che vanno ben oltre quelli finora attribuiti a questa proteina.