Analisi del potenziale angiogenico di biomateriali osteogenici innovativi stampati in 3D per l'ingegneria del tessuto osseo

In the last decades, the progressive aging of the population and the increasing incidence of musculoskeletal diseases have enhanced the demand for innovative solutions in bone regeneration. Bone tissue engineering (BTE) fits into this context with the aim to support bone regeneration while providing 3D porous structures combining cells, biomaterials and chemical factors together. However, current solutions scarcely consider the role of the vascular component in reparative osteogenesis. In fact, bone is a highly vascularized tissue in which the formation of a functional vascular network is of primary importance during embryonic development as well as during fracture repair. Even if bone has a high regenerative capacity, in particular conditions such as critical-size fractures or degenerative diseases, restoring the vascular network is preliminary to all osteogenic processes, and consequently to regeneration itself. For this reason, the aim of this thesis project was to evaluate the angiogenic potential of different osteogenic materials with in vitro and in vivo models, both at morphological and molecular level. Three promising solutions were investigated: 1) bioplastics; 2) bone powder; 3) bioactive glasses. Regarding bioplastics, currently there is a strong focus on biological and biodegradable materials for environmental reasons. Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBH) is a compostable bioplastic with great biocompatibility, high versatility and good mechanical properties. To reduce the cost of this polymer, part of the amount of PHBH was replaced with acetylated cellulose nanocrystals (CNCs). In vitro and in vivo analyses showed that the scaffolds obtained via fused filament fabrication (FFF) with the geometry of 350–400 μm pore size displayed the highest angiogenic potential; among these, the most promising compositions were 10 and 15 wt% CNCs. Regarding the bone powder, Pal-OS® derives from the scleral ossicles (SOs), naturally decellularized bone plates, localized at the scleral-corneal border of the eyeballs of lower vertebrates. Since the SOs are biocompatible, pro-osteogenic, and not immunogenic, the Pal-OS® powder was produced to better exploit these properties in BTE applications. Specifically, Pal-OS® was printed with a micro-extrusion technique together with different hydrogels, but the scaffolds did not show satisfactory results in terms of angiogenic response. Lastly, bioactive glasses (BGs) have been evaluated due to their ability to bond with bone tissue. BGMS10 and Bio_MS are two novel compositions, created by adding strontium and magnesium ions to the original 45S5 bioglass to improve the crystallization temperature and the bioactivity of the gold standard. The three BGs were tested both in the form of granules and scaffolds to evaluate which 3D structure better displays the highest angiogenic potential. In vitro and in vivo analyses showed that the granules have a higher angiogenic potential than scaffolds, and that BGMS10 and Bio_MS are more angiogenic than 45S5. Molecular investigations of quantitative polymerase chain reaction (PCR) related to the gene expression of angiogenic markers, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor, allowed to quantify the angiogenic response of the granules, further characterizing it over time and confirming the morphological data. In conclusion, these results demonstrated that, among the material tested, bioactive glasses may be the most promising solution for BTE applications, laying the foundations for bridging the gap between preclinical research and clinical practice.

Negli ultimi decenni, il progressivo invecchiamento della popolazione e la crescente incidenza di malattie muscolo-scheletriche hanno aumentato la richiesta di soluzioni innovative per la rigenerazione ossea. L'ingegneria del tessuto osseo si inserisce in questo contesto con l'obiettivo di fornire strutture 3D porose che combinino insieme cellule, biomateriali e fattori chimici. Tuttavia, le soluzioni attuali non considerano sufficientemente il ruolo della componente vascolare nell’osteogenesi riparativa, che risulta cruciale in quanto l’osso è un tessuto altamente vascolarizzato. Nell’osso la formazione di una rete vascolare funzionale è di primaria importanza sia durante lo sviluppo embrionale che durante la riparazione di fratture. Nonostante l'elevata capacità rigenerativa, in condizioni particolari, come fratture di taglia critica o malattie degenerative, ripristinare la rete vascolare è preliminare a tutti i processi osteogenici, e di conseguenza alla rigenerazione stessa. Per questo motivo, lo scopo di questo progetto di tesi è stato valutare il potenziale angiogenico di diversi materiali osteogenici con modelli in vitro e in vivo, sia a livello morfologico che molecolare. In particolare, sono state studiate tre soluzioni: 1) bioplastiche; 2) polvere d'osso; 3) vetri bioattivi. In merito alle bioplastiche, ad oggi c’è una forte attenzione verso materiali biologici e biodegradabili per motivi ambientali. Il poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossiesanoato) (PHBH) è una bioplastica compostabile con elevata biocompatibilità, versatilità e buone proprietà meccaniche. Per abbatterne il costo, parte di PHBH è stata sostituita con nanocristalli di cellulosa acetilati (CNC). Tra gli scaffold di PHBH ottenuti tramite stampa 3D a estrusione, quelli con 350-400 μm di porosità hanno mostrato un alto potenziale angiogenico; tra questi, le composizioni contenenti il 10 e il 15% di CNC sono risultate essere più promettenti sia in vitro che in vivo. In merito alla polvere d’osso, Pal-OS® è un derivato dagli ossicini sclerali (OS), segmenti ossei naturalmente decellularizzati localizzati al confine sclero-corneale dei bulbi oculari dei vertebrati inferiori. Poiché gli OS sono biocompatibili, pro-osteogenici e non immunogenici, la polvere Pal-OS® è stata prodotta per sfruttare al meglio queste proprietà nelle applicazioni di ingegneria del tessuto osseo. La Pal-OS® è stata stampata con una tecnica di micro-estrusione insieme a diversi idrogel, ma gli scaffold non hanno mostrato risultati soddisfacenti in termini di risposta angiogenica. In merito ai vetri bioattivi, è nota la loro capacità di legarsi al tessuto osseo. Sono state testate due nuove composizioni, BGMS10 e Bio_MS, create aggiungendo ioni stronzio e magnesio al biovetro originale 45S5 per ottenere temperature di cristallizzazione e bioattività più elevate rispetto allo standard. I tre vetri sono stati testati sia sotto forma di granuli che di scaffold per valutare quale struttura 3D abbia il più alto potenziale angiogenico. Le analisi in vitro e in vivo hanno dimostrato che i granuli hanno un potenziale angiogenico superiore agli scaffold, e che BGMS10 e Bio_MS sono più angiogenici di 45S5. Le indagini molecolari di PCR quantitativa relative all’espressione genica dei marcatori dell’angiogenesi, quali il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF) e il suo recettore, hanno permesso di quantificare la risposta angiogenica dei granuli, caratterizzandola ulteriormente nel tempo e confermando i dati morfologici. In conclusione, questi risultati hanno dimostrato che, tra i materiali testati, i vetri bioattivi possono essere la soluzione più promettente per le applicazioni di ingegneria del tessuto osseo, ponendo le basi per collegare ricerca preclinica e pratica clinica.