He-RASE: un modello cellulare per lo screening rapido e affidabile dei sistemi CRISPR/Cas per l'editing di mutazioni dominanti

The CRISPR/Cas system is a promising approach for treating a variety of genetic disorders and it can potentially address autosomal dominant mutations by disrupting mutant alleles via the Non-Homologous End Joining (NHEJ) DNA repair pathway. However, the low specificity of the Cas nuclease poses a challenge as many single-nucleotide dominant mutations cannot be targeted due to the inability to distinguish between mutated and wild-type alleles. Thus, developing a highly specific Cas nuclease capable of efficient allele-specific single-nucleotide discrimination is critical to broaden the range of dominant diseases that can be tackled. Although many new and/or engineered Cas nucleases have been identified, targeting the mutations responsible for dominant genetic diseases remains challenging due to the rarity of some diseases and limited availability of affected patients' cells. To address this issue, we developed He-RASE (HEK293T Reporter-based Allele-Specific Editing), a cell line based on HEK293T that mimics the "biallelic context" of the dominant disease. To test this, we introduced a TP63 heterozygous missense mutation causing a rare dominant genetic disease known as Ectrodactyly-Ectodermal Dysplasia-Cleft lip palate (EEC). Mimicking EEC patients' TP63 loci enabled us to screen the engineered nucleases effectively and functionally. This screening allowed us to identify the most promising candidates both for editing efficiency and allele-specificity. The established cellular model precisely mimics the heterozygosity of dominant mutations and replicates the genomic biallelic context. He-RASE can be extended to many other genes that cause autosomal dominant diseases and allows a quick and reliable system to screen many new Cas nucleases.

Il sistema CRISPR/Cas è un promettente sistema per il trattamento di numerose malattie genetiche e può potenzialmente essere utilizzato per le mutazioni autosomiche dominanti grazie alla sua capacità di distruggere l’allele mutante attraverso la via di riparo del DNA della Non-Homologous End Joining (NHEJ). Nonostante questo, la bassa specificità della nucleasi Cas rappresenta una sfida poiché molte mutazioni dominanti sono a singolo nucleotide e quindi non possono essere modificate a causa dell’impossibilità della Cas di distinguere tra l’allele normale e quello mutante. Per questo motivo sviluppare una nucleasi Cas che sia in grado di discriminare in modo efficiente il singolo nucleotide di differenza tra i due alleli è uno step fondamentale per aumentare il numero di malattie genetiche dominanti che possano essere approcciate con il sistema CRISPR/Cas. Sebbene diverse Cas nuove e/o ingegnerizzate siano state identificate, la possibilità di utilizzarle per le mutazioni responsabili delle malattie genetiche dominanti rimane una sfida a causa della rarità di alcune di queste malattie e della limitata disponibilità di cellule di pazienti affetti da esse. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato He-RASE (HEK293T Reporter-based Allele-Specific Editing), una linea cellulare basata sulle HEK293T che mima il contesto biallelico della malattia dominante. Per testare il sistema, abbiamo introdotto una mutazione di TP63 in eterozigosi che causa, nel paziente, una malattia genetica dominante rara conosciuta come sindrome da ectrodattilia-displasia ectodermica-labio palatoschisi (EEC). Mimando in questo modo i loci di TP63 dei pazienti, siamo stati in grado di provare diverse nucleasi Cas per la loro capacità di modifica effettiva e funzionale dell’allele mutante. Questo screening ci ha permesso di identificare i candidati più promettenti sia dal punto di vista dell’attività della nucleasi che della sua specificità per l’allele mutato. Il modello cellulare così generato si è dimostrato efficiente nel mimare in modo accurato l’eterozigosità delle mutazioni dominanti e nel replicare il contesto biallelico dei pazienti. Il sistema He-RASE può inoltre essere esteso a diversi altri geni che causano malattie genetiche dominanti e costituisce un sistema rapido e affidabile per lo screening di molte nucleasi Cas.