Variazioni legate all'età nelle cellule stromali mesenchimali umane derivate da midollo osseo: impatto su morfologia, profilo di espressione genica, attività immunomodulatrice ed espressione dei miRNA.

Mesenchymal stromal cells (MSC) are one of the main cellular components of the bone marrow microenvironment. An important feature of MSC is their immunomodulating capacity, partially mediated by secreted cytokines and extracellular vesicles (EVs). With host aging, MSC also undergo age-related changes, which play an important role in the pathogenesis of several diseases of the elderly, often related to a persistent low-grade systemic pro-inflammatory status defined “inflammaging”. MSC present a promising therapeutic potential in several medical fields (regenerative medicine, autoimmune and chronic inflammatory disorders, neoplastic disorders) which rely on their genetic stability, poor immunogenicity, reparative and immunomodulatory abilities. The main aim of this project was to identify molecular and functional alterations of mesenchymal stem cells (MSC) derived from young and elderly bone marrow healthy donors. Different characteristics have been evaluated: -MSC morphology, phenotype and expansion; -Markers of senescence; -Expression of genes implicated in cell proliferation, hematopoietic support, immunomodulation; -MSC response to inflammatory priming; -Immunomodulatory potential of MSC and EVs: effects on macrophage polarization; -Establishment and comparison of the miRnome of MSC. MSC derived from elderly donors are large, flat and more granular and display increased population doubling time and p16 and p21 expression. We reported an increased expression of pro-inflammatory genes (TGF-beta, GAL1, IL-6, IL-8) in older patients in response to inflammatory priming. MSC show a significant impact on macrophage polarization towards M1 and M2 status: particularly, MSC from young donors induced a reduction of typical M1 markers expression such as CCL2 and TNF-alfa, and enhance the switch to anti-inflammatory M2 status, as shown by increased levels of IL-10, TGM2, and CD206 on both THP-1 cells and monocyte-derived macrophages (MDMs). Moreover, this effect is less marked when using replicative senescent MSC from the same donors. The majority of EVs derived from MSC showed a size of 100-250 nm and were actively phagocytosed by macrophages. The analysis of miRNA expression in EVs revealed a significant difference for miRNA known to be involved in macrophage polarization and particularly the expression of miR-193b-3p is strongly increased after co-culture of macrophages with MSC. This miRNA regulates a biological pathway leading to CCL2 down-expression through STAT1 regulation and preliminary data suggest that this might be one of the pathways explaining MSC immunomodulating activity. These results suggest that: 1) MSC show differences in size, morphology, colony-forming ability; 2) MSC gene expression profile seems to vary according to subjects’ age and particularly in old donors seem to be characterized by an impaired immunomodulating activity, with a reduced inhibition of macrophage M1 status; 3) Macrophage polarization could be strongly influenced by EVs activity through miRNA production which seems to vary according to donors’ age.

Le cellule mesenchimali stromali (MSC) sono cellule multipotenti che rappresentano una componente fondamentale del microambiente del midollo osseo. Un importante funzione esercitata dalle MSC è la capacità di modulare l'intensità della risposta immunitaria attraverso la produzione e secrezione di citochine e di vescicole extracellulari (EVs). Con l'invecchiamento dell'ospite, anche le MSC subiscono dei cambiamenti legati alla senescenza, che giocano un ruolo importante nella patogenesi di numerose malattie dell'anziano, spesso associate ad una infiammazione di basso grado, cronica e sistemica definita “inflammaging”. Le MSC rappresentano un target terapeutico promettente in molti ambiti della medicina (medicina rigenerativa, malattie autoimmuni ed infiammatorie croniche, patologie oncologiche) grazie alla loro stabilità genetica, scarsa immunogenicità e significative abilità di rigenerazione ed immunodulazione. Lo scopo principale di questo progetto è stato di identificare alterazioni molecolari e funzionali delle MSC isolate dal midollo osseo di soggetti sani, giovani ed anziani. Differenti caratteristiche sono state studiate: -la morfologia, il fenotipo e la capacità replicativa delle MSC; -i marcatori di senescenza; -l'espressione di geni implicati nella proliferazione cellulare, nel supporto ematopoietico, nell'immunomodulazione; -l'attività delle MSC in risposta ad un ambiente infiammatorio; -il potenziale immunomodulatorio di MSC ed EVs: effetti sulla polarizzazione dei macrofagi; -il miRnoma delle MSC. Le MSC isolate da donatori anziani presentano taglia e granularità maggiori e dimostrano un tempo di raddoppiamento nonché l'espressione di p16 e p21 aumentate. Abbiamo riscontrato un aumento dell'espressione di geni pro-infiammatori (TGF-beta, GAL1, IL-6, IL-8) nei soggetti anziani in risposta ad un ambiente infiammatorio. Le MSC hanno mostrato un impatto significativo sulla polarizzazione dei macrofagi verso i fenotipi M1 ed M2: in particolare, MSC isolate da donatori giovani sono associate ad una ridotta espressione di marcatori tipici del fenotipo pro-infiammatorio M1 (CCL2 e TNF-alfa) e ad un'incrementata espressione di marcatori del fenotipo anti-infiammatorio M2 (IL-10, TGM2 e CD206). Questo effetto risulta meno marcato ripetendo lo stesso test dopo induzione di uno stato di senescenza replicativa nelle MSC degli stessi donatori. Questi dati sono stati confermati sia su macrofagi derivati dalla linea cellulare THP-1 che su macrofagi derivati da monociti circolanti (MDMs) di soggetti sani. L'analisi dell'espressione dei miRNA delle MSC ha mostrato delle differenze in diversi miRNA conosciuti per avere un ruolo significativo in alcuni processi di immunomodulazione: in particolare l'espressione di miR-193b-3p risulta notevolmente incrementata dopo co-cultura dei macrofagi con le MSC isolate da donatori giovani. Questo miRNA sembra regolare una via biologica che porta alla sottoregolazione di CCL2 attraverso la regolazione di STAT1 e quindi giocare un ruolo importante nell'attività di immunomodulazione esercitata dalle MSC. Questi risultati suggeriscono che: 1) le MSC di soggetti di diversa età mostrano delle differenze in taglia, morfologia e capacità di proliferazione; 2) l'espressione genica delle MSC sembra variare a seconda dell'età dei donatori: nei soggetti anziani le MSC presentano una limitata capacità di immunomodulazione ed in particolare una ridotta inibizione dell'attività pro-infiammatoria dei macrofagi con fenotipo M1; 3) la polarizzazione de macrofagi sembrerebbe essere fortemente influenzata dall'attività di alcuni miRNA prodotti dalle MSC e tale produzione varia secondo l'età.