Caratteristiche clinico-patologiche, paesaggio trascrittomico ed implicazioni terapeutiche del 5’-ectonucleotidase CD73 (NT5E) nel tumore delle vie biliari: studio BILIARY73

Introduction. Despite the improved outcome with the addition of the anti-PD-L1 durvalumab to standard treatment, the vast majority of BTC do not benefit from chemo-immunotherapy. Immunosuppressive microenvironment is a dominant feature of BTC, involved in tumour progression and drug resistance. Here, we investigated the biological role and treatment implications of the adenosine-producing enzyme CD73 in a clinically-annotated cohort of BTC. Methods. Immunohistochemistry for CD73, CD4/CD8 and FOXP3, whole-exome and transcriptomic sequencing were performed on resected specimens of 80 BTC (Illumina Platform). Spatial Transcriptomics was performed by using Visium Spatial Gene Expression-10x Genomics. Tumor growth was assessed in 2D and 3D culture by using MTS assay and spheroid growth analysis. Survival and correlation analyses were performed. Results. High CD73 expression (CD73high) was associated with older age (p=0.01), gallbladder subsite (p=0.03), and nodal involvement (p=0.04). CD73high tumours were significantly enriched in FOXP3+ T lymphocytes (p<0.001). CD73high status was independent predictor of poorer prognosis at the multivariate analysis (p=0,03), with ECOG PS =2 (p=0,001) and the pathological stage (p=0,025) and was associated with a remarkably shorter RFS in patients treated with adjuvant chemotherapy (p=0,011). Transcriptomically, CD73high tumours were significantly enriched in upregulated EMT, TNF-alfa/NFKB, hypoxia and G2/M checkpoint signaling pathways and p53, BMI1, MEL18, EGFR and K-RAS genes. In in vitro models, siRNA-mediated depletion and CRISPR-CAS9 gene KO of CD73 sensitized both BTC 2D and 3D culture to cisplatin/gemcitabine treatment. The pharmacological inhibition of CD73 by AMCP improved the sensitivity of BTC cell lines to cisplatin/gemcitabine treatment. Finally, spatially resolved transcriptomics of CD73high revealed a critical role of CD73 in tumor immunity and therapeutic response. Conclusions. We showed that CD73high BTC display aggressive biological features, poorer prognosis and resistance to standard chemotherapy. The therapeutic targeting of this adenosinergic ectonucleotidase by clinically-available compounds has the potential to enhance the efficacy of conventional treatment in BTC.

Introduzione. Nonostante il miglioramento dell’outcome con l'aggiunta dell’agente anti-PD-L1 Durvalumab al trattamento standard, la stragrande maggioranza dei BTC non trae beneficio dalla chemio-immunoterapia. Il microambiente immunosoppressivo è una caratteristica dominante del BTC, essendo coinvolto nella progressione del tumore e nella resistenza ai farmaci. In questo lavoro, abbiamo studiato il ruolo biologico e le implicazioni terapeutiche dell'enzima adenosina-producente CD73 in una coorte clinicamente-annotata di BTC. Metodi. L’analisi molecolare è stata svolta con l'immunoistochimica per CD73, CD4/CD8 e FOXP3, e mediante il sequenziamento dell’intero esoma e dell’intero trascrittoma su campioni resecati di 80 BTC (Piattaforma Illumina). La trascrittomica spaziale è stata eseguita utilizzando Visium Spatial Gene Expression-10x Genomics. La crescita del tumore è stata valutata in coltura 2D e 3D utilizzando il test MTS e l'analisi della crescita degli sferoidi. Sono state inoltre eseguite analisi di sopravvivenza e di correlazione con le principali variabili clinico-patologiche. Risultati. In questo studio, l'elevata espressione di CD73 (CD73high) è risultata associata all'età avanzata alla diagnosi (p=0,01), alla sottosede della cistifellea (p=0,03) e al coinvolgimento nodale (p=0,04). I tumori CD73high sono risultati significativamente arricchiti di linfociti T FOXP3+ (p<0,001) e lo stato CD73high è risultato essere predittore indipendente di peggior prognosi all'analisi multivariata (p=0,03), insieme ad ECOG PS =2 (p=0,001) e stadio patologico (p=0,025). Inoltre, i tumori CD73high sono stati associati ad una RFS notevolmente più breve nei pazienti trattati con chemioterapia adiuvante (p=0,011). Dal punto di vista trascrittomico, i tumori CD73high hanno presentato una up-regolazione delle vie di segnalazione dell’EMT, TNF-alfa/NFKB, ipossia e del checkpoint cellulare G2/M e dei geni p53, BMI1, MEL18, EGFR e K-RAS. In modelli preclinici in vitro, la deplezione mediata da siRNA ed il knock-out CRISPR-CAS9-mediato del gene CD73 hanno aumentato la sensibilità delle colture BTC 2D e 3D al trattamento con cisplatino/gemcitabina. L'inibizione farmacologica di CD73 da parte dell’inibitore dell’ectonucleotidasi AMCP ha migliorato la sensibilità delle linee cellulari di BTC al trattamento con cisplatino/gemcitabina. Infine, la trascrittomica spaziale ha rivelato un ruolo critico di CD73 nell'immunità tumorale e nella risposta terapeutica. Conclusioni. In questo studio, abbiamo dimostrato che i BTC CD73high presentano caratteristiche biologiche di aggressività, prognosi peggiore e resistenza alla chemioterapia standard. Il targeting terapeutico di questa ectonucleotidasi adenosinergica da parte di composti clinicamente disponibili ha il potenziale per migliorare l'efficacia del trattamento convenzionale nel BTC.