FOXM1 supporta il self-renewal e i processi di riparo del DNA nelle cellule staminali epidermiche umane

Human clonogenic epidermal keratinocytes can initiate three types of clones, referred to as holoclones, meroclones and paraclones. Holoclone-forming cells are long-lived epidermal stem cells (ESC) and give rise to meroclone- and paraclone-forming cells (transient amplifying progenitors - TAC), eventually generating terminally differentiated keratinocytes. Gene therapy of LAMB3-dependent Junctional Epidermolysis Bullosa (JEB) proved that holoclone-forming cells are responsible for long-term restoration of a functional transgenic epidermis. Taking advantage of single cell-based technologies, we defined the transcriptional profile of ESC, TAC and differentiated cells. Bioinformatic analysis highlighted that holoclone-forming cells display stem cell features, such as genes regulating DNA repair, chromosome segregation, microtubule organization and telomerase activity. Bulk and single-cell transcriptional profiling allowed to identify FOXM1 as a key transcription factor required for stem cell maintenance in healthy donor-derived keratinocytes. In this project, we investigated the role of FOXM1 in JEB keratinocytes, marked by a progressive exhaustion of holoclones, which are rescued by gene therapy and by long-term, lentiviral vector-mediated over-expression of FOXM1. Enforced FOXM1 can restore the clonogenic ability and proliferative capacity of JEB epidermal cells and sustain JEB holoclone-forming cells, at a level comparable to that of LAMB3-gene therapy. It is known that FOXM1 has an important role in DNA repair processes in pluripotent stem cells and many cancer types. DNA repair pathway is one of the features of ESC, as it is crucial to prevent the propagation of genotoxic mutations in derived progenitor cells. Therefore, we studied if ESC and TAC display different DNA repair dynamics after irradiation (UV or x-ray) and if FOXM1 is involved in this process. At basal levels, proteins involved in the DNA damage response (DDR), specifically in homologous recombination (HR), are more expressed in ESC as compared to TAC. After X-ray and UV irradiation, DNA double strand breaks (DSB) are marked by γH2AX that progressively disappears within 48h. Already 1h after irradiation, P53 is stabilized and BRCA1, BRCA2 and phosphoNBS1 localize at the DSB. We observed also FOXM1 stabilization, which might be instrumental to foster the repair process as keratinocytes treated with FOXM1 specific siRNA display a reduced accumulation of p53, RBBP8 and RAD51. In addition, in keratinocytes cultures enriched in ESC, we observed the expression of apoptotic markers in cells where DNA lesions could not be repaired, suggesting the activation of a specific death program, likely to prevent the propagation of mutations. Clonal analysis after irradiation will tell if holoclone-forming cells, compared to TAC, activate a specific DDR. This study identifies FOXM1 as a key transcription factor regulating holoclone forming cells in healthy and JEB-derived keratinocytes, probably acting to guarantee genomic fidelity during ESC proliferation and differentiation. These findings will allow a better control of the stem cell content in cultured epidermal graft and provide molecular tools to improve gene-editing approaches, for example to treat dominant forms of Epidermolysis Bullosa.

I cheratinociti clonogenici umani generano tre tipi di cloni definiti come olocloni, merocloni e paracloni. Le cellule che compongono l’oloclone sono le cellule staminali epidermiche (ESC) e danno origine ai merocloni e paracloni (cellule ad amplificazione transiente - TAC) generano i cheratinociti terminalmente differenziati. La terapia genica per l’epidermolisi bollosa giunzionale (JEB) LAMB3-dipendente ha dimostrato che gli olocloni sono responsabili della rigenerazione a lungo termine della pelle transgenica funzionale. Grazie ad analisi a singola cellula, abbiamo definito il profilo trascrizionale delle ESC, delle TAC e delle cellule differenziate. Analisi bioinformatiche hanno evidenziato che gli olocloni esprimono gruppi di geni tipici delle cellule staminali, come geni che regolano il riparo del DNA, la segregazione cromosomica, l’organizzazione dei microtubuli e l’attività telomerasica. L’analisi trascrittomica in bulk e a singola cellula ha permesso di identificare FOXM1 come un fattore di trascrizione chiave per il mantenimento delle cellule staminali in cheratinociti derivati da donatore sano. In questo progetto, abbiamo studiato il ruolo di FOXM1 nei cheratinociti derivati da paziente affetto da JEB. La JEB è caratterizzata da una progressiva perdita degli olocloni, i quali vengono recuperati con la terapia genica e anche a seguito dell’espressione a lungo termine di FOXM1 mediata un vettore lentivirale. FOXM1 è in grado di ristabilire il potenziale clonogenico e proliferativo dei cheratinociti affetti da JEB e di sostenere gli olocloni, con effetti comparabili a quelli ottenuti con la terapia genica per LAMB3. È noto che FOXM1 ha un ruolo importante nei meccanismi di riparo del DNA sia in cellule staminali pluripotenti che in diverse tipologie di cancro. La pathway del riparo del DNA è fortemente rappresentata nelle ESC poiché è cruciale per evitare la propagazione di mutazioni genotossiche alle cellule progenitrici. Abbiamo quindi studiato se, a seguito dell’esposizione a raggi X e raggi UV, le ESC attivano meccanismi di riparo differenti rispetto alle TAC e se FOXM1 è coinvolto in questo processo. A livelli basali, proteine coinvolte nella risposta al danno al DNA e in particolare nella ricombinazione omologa, sono più espresse nelle ESC rispetto ai progenitori. A seguito di esposizione a raggi X e UV, i tagli a doppio filamento (DSB) sul DNA vengono contrassegnati da γH2AX, la cui espressione diminuisce progressivamente nell’arco di 48h. Già 1h dopo l’irraggiamento, osserviamo la stabilizzazione di P53 e la localizzazione di BRCA1, BRCA2 e fosfoNBS1 sul DNA, in corrispondenza dei (DBS). Abbiamo osservato anche la stabilizzazione di FOXM1, che potrebbe essere fondamentale per promuovere il processo di riparo. Infatti, i cheratinociti irraggiati e trattati con un siRNA specifico per FOXM1, presentano un ridotto accumulo di P53, RBBP8 e RAD51. Inoltre, in colture di cheratinociti arricchite di ESC, abbiamo osservato l’espressione di marcatori di apoptosi nelle cellule in cui le lesioni al DNA non erano state riparate. Questo suggerisce l’attivazione di un programma di morte specifico per evitare la propagazione delle mutazioni. L’analisi clonale fatta dopo l’irraggiamento dirà se gli olocloni attivano una specifica risposta al danno al DNA. Questo studio identifica FOXM1 come un fattore di trascrizione chiave in grado di regolare gli olocloni in cheratinociti derivati da donatori sani e affetti da JEB, che probabilmente agisce per garantire l’integrità del genoma durante la proliferazione e il differenziamento delle ESC. Queste scoperte permetteranno di avere più controllo sul contenuto di cellule staminali di un lembo epidermico coltivato in laboratorio e forniranno alcuni strumenti molecolari per migliorare approcci di gene editing volti a trattare, ad esempio, forme dominanti di EB.