Il canale melanosomiale a due pori di tipo 2 come nuovo bersaglio terapeutico per il trattamento del melanoma maligno

Melanoma, the deadliest type of skin cancer, is a heterogeneous disease presenting many variants, responsible for an unpredictable treatment efficacy and disease outcome. Although early melanoma can be cured by surgical excision, despite remarkable efforts, metastatic melanoma remains a fatal disease because tumors rapidly develop resistance to novel therapies. Recently, it has been hypothesized that melanoma melanosomes have a role in promoting melanoma. Melanosomes and intracellular acidic compartments present the two-pore channel 2 (TPC2), an ionic channel that regulates a number of cellular functions by releasing Ca2+/Na+ in response to nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) or to phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]. In particular, NAADP inhibition has been shown to strongly reduce the growth and invasiveness of murine melanoma cells, while in two human cell lines, TPC2 silencing gave contrasting results. In addition, it has been hypothesized that melanosomes, released by melanoma cells, are incorporated by normal fibroblasts and responsible for the phenotypic switch into Cancer Associated Fibroblast (CAFs) in patients’ dermis, thus promoting the formation of the tumor primary niche. Giving this evidence, we speculate that the prevention of melanosomes’ release from melanoma could impair the formation of the dermal tumor niche and then blockade the metastatic invasion. To evaluate the role of TPC2 in melanoma progression, first of all, we observed that differential amounts of TPC2 are expressed in human primary melanoma subtypes with different stages and origins, as well as in human primary and metastatic melanoma cell lines both in two-dimensional cultures and in a three-dimensional models based on multicellular spheroids. After treatment with Naringenin (Nar), a natural inhibitor of TPC2, we observed a dose and time dependent inhibition of growth and a reduction of total spheroid areas. Moreover, after TPC2 silencing or Nar treatment, 2D and 3D melanoma models are characterized by a lower migratory and invasive capacity in Collagen I and a decrease expression of tumor progression markers. In particular, we observed a switch from N- to E-cadherin expression, suggesting a role of TPC2 in the epithelial-to-mesenchymal transition. In addition, to investigate the involvement of TPC2 in melanosome release, in melanoma cell treated with Nar we observed an increase expression of melanosomal markers and elevate level of intracellular melanin while the release of melanin does not occur. Finally, fibroblasts treated with conditioned medium of melanoma cells show melanosomal markers expression, increase expression of markers of CAFs and migratory capacity, while Nar treated melanoma cells do not induce the same effect on fibroblasts. These results suggest that the ionic channel TPC2 seems to play a role in melanoma progression, being an interesting new therapeutical target. Thus, Nar could represent a new potential candidate for melanoma treatment, acting on both tumor cells and microenvironment.

Il melanoma, il tipo più letale di cancro della pelle, è una malattia eterogenea che presenta molte varianti, responsabili di una efficacia non prevedibile del trattamento e dell’esito della malattia. Sebbene il melanoma se diagnosticato nelle fasi precoci può essere asportato chirurgicamente, il melanoma metastatico, nonostante notevoli sforzi, rimane una malattia fatale poiché sviluppa rapidamente resistenza alle nuove terapie. Recentemente, è stato ipotizzato che i melanosomi del melanoma svolgano un ruolo nel promuovere lo sviluppo del melanoma. I melanosomi e i compartimenti acidi intracellulari presentano sulla loro membrana il canale a due pori di tipo 2 (TPC2), un canale ionico coinvolto in diverse funzioni cellulari che rilascia Ca2+/Na+ in risposta all'acido nicotinico adenin dinucleotide fosfato (NAADP) o al fosfatidililinositolo 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P2]. In particolare, l'inibizione del NAADP riduce fortemente la crescita e l'invasività delle cellule murine di melanoma, mentre in due linee cellulari umane, il silenziamento di TPC2 ha dato risultati contrastanti. Inoltre, è stato ipotizzato che i melanosomi, rilasciati dalle cellule del melanoma, siano incorporati dai fibroblasti e responsabili della trasformazione fenotipica in fibroblasti associati al cancro (CAFs) promuovendo così la formazione di una nicchia tumorale primaria nel derma dei pazienti. Questi studi ci portano ad ipotizzare che prevenire il rilascio dei melanosomi da parte del melanoma potrebbe inibire la formazione della nicchia tumorale dermica e quindi bloccare l'invasione metastatica. Per comprendere il ruolo di TPC2 nella progressione del melanoma, prima di tutto, abbiamo osservato che sottotipi di melanoma primario umano con differenti stadi e sedi d’origine esprimono diverse quantità di TPC2. Allo stesso modo si osserva una diversa espressione del canale in linee cellulari di melanoma primario e metastatico umano utilizzate sia in coltura bidimensionale che in un modello tridimensionale basato su sferoidi multicellulari. Dopo il trattamento con Naringenina (Nar), un inibitore naturale di TPC2, abbiamo osservato una riduzione dose e tempo dipendente della proliferazione cellulare e dell’area totale degli sferoidi. Inoltre, i modelli 2D e 3D di melanoma sono caratterizzati da una minore capacità migratoria ed invasiva nel collagene I e da una ridotta espressione dei marcatori di progressione tumorale dopo il silenziamento di TPC2 o il trattamento con Nar. In particolare, abbiamo osservato un passaggio di espressione dalla N- alla E-caderina, che suggerisce un ruolo di TPC2 nella transizione epiteliale-mesenchimale. Inoltre, per valutare il coinvolgimento di TPC2 nel rilascio dei melanosomi, abbiamo osservato in cellule di melanoma trattate con Nar un aumento di espressione dei marcatori melanosomiali e un livello elevato di melanina intracellulare, mentre non si è verificato il rilascio di melanina. Infine, abbiamo osservato che i fibroblasti trattati con il terreno condizionato delle cellule di melanoma esprimono i marcatori melanosomiali, aumentano l'espressione dei marcatori dei CAFs e la capacità migratoria, mentre le cellule di melanoma trattate Nar non inducono lo stesso effetto nei fibroblasti. Questi risultati suggeriscono che il canale ionico TPC2 svolga un ruolo nella progressione del melanoma, dimostrandosi un interessante nuovo bersaglio terapeutico. Pertanto, la Nar potrebbe rappresentare un nuovo potenziale candidato per il trattamento del melanoma, agendo sia sulle cellule che sul microambiente del tumore.