Verso lo sviluppo di una terapia genica ex vivo per l’Ittiosi Lamellare TGM1-dipendente

Lamellar ichthyosis (LI) is an autosomal recessive congenital ichthyosis (ARCI) characterized by generalized skin dryness, hyperkeratosis and appearance, since the first week of life, of coarse and brown/dark scales. LI is usually caused by mutations in TGM1 gene, which encodes transglutaminase 1, an enzyme expressed in all keratinized stratified squamous epithelia and involved in skin barrier formation. To date, no therapies targeting the molecular cause of the disease are still available and current therapies only focus on symptomatic relief. In this project, we propose to develop an ex vivo gene therapy approach for the treatment of LI patients, based on the generation of autologous cultured epidermal sheets containing genetically corrected epidermal stem cells. An integrating-viral vector with a physiological promoter has been developed to assess tissue- and stratum-specific expression of TGM1 gene in primary keratinocytes. Organotypic skin cultures have been realized to evaluate the protein expression and the rescue of enzyme function during the keratinocyte differentiation process in a biomimetic, physiological environment. In addition, due to the rarity of the disease and the difficulties to retrieve skin biopsies, TGM1 biallelic knockout was established using the CRISPR/Cas9 technology in human primary keratinocytes to generate a cellular model for LI. Such model has been employed for a proof of concept in preclinical research settings, waiting for primary clonogenic keratinocytes derived from LI patients. Gene-corrected TGM1-null keratinocytes displayed proper TGM1 expression and enzymatic activity in the organotypic skin culture system, consistent with proper differentiative epidermal architecture. Such gene therapy approach demonstrated the restoration of cornified envelope formation comparable to level seen in normal keratinocytes, indicating functional correction of the proposed primary pathophysiologic defect in LI. This preliminary preclinical study supports a potential development of an ex vivo gene therapy approach to permanently regenerate a fully functional epidermis in patients suffering from this devastating skin disease.

L'ittiosi lamellare (LI) fa parte del più ampio gruppo di ittiosi congenite autosomiche recessive (ARCI) i cui sintomi principali sono: (i) la secchezza cutanea generalizzata, (ii) l’ipercheratosi e (iii) la comparsa, sin dalla prima settimana di vita, di squame grossolane e bruno/scure. LI è solitamente causata da mutazioni nel gene TGM1, che codifica per la transglutaminasi 1, un enzima espresso in tutti gli epiteli squamosi stratificati e cheratinizzati, che è coinvolto nella formazione della barriera cutanea. Ad oggi, non sono ancora disponibili terapie che mirino a risolvere la causa molecolare della malattia e le attuali terapie si concentrano solo sul sollievo dei sintomi. In questo progetto, proponiamo di sviluppare un approccio di terapia genica ex vivo per il trattamento di pazienti con LI, basato sullo sviluppo di foglietti di epidermide autologa contenenti cellule staminali epidermiche geneticamente corrette. È stato sviluppato un vettore virale integrante con un promotore fisiologico per valutare l'espressione strato-specifica del gene TGM1 nei cheratinociti primari. Sono state realizzate colture cutanee organotipiche per valutare l'espressione proteica e il recupero della funzione enzimatica durante il processo di differenziamento dei cheratinociti in un ambiente biomimetico e fisiologico. Inoltre, a causa della rarità della malattia e della difficoltà di recuperare le biopsie cutanee, è stato stabilito il knockout biallelico di TGM1 utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 nei cheratinociti primari umani per generare un modello cellulare per LI. Tale modello è stato impiegato per come prova di principio in un contesto di ricerca preclinica, in attesa di ottenere le cellule derivate da pazienti. I cheratinociti TGM1-null con correzione genica hanno mostrato la corretta espressione del TGM1 e il ripristino dell'attività enzimatica nel sistema di coltura organotipico, coerentemente con un'adeguata architettura epidermica. Tale approccio di terapia genica ha dimostrato il ripristino della formazione dell'involucro cornificato nei cheratinociti differenziati geneticamente corretti, indicando la correzione funzionale del difetto fisiopatologico primario associato a LI. Questo studio preliminare supporta un potenziale sviluppo di un approccio di terapia genica ex vivo per la rigenerazione permanentemente di un'epidermide completamente funzionale nei pazienti affetti da questa devastante malattia della pelle.