Caratterizzazione molecolare della degenerazione dei bastoncelli dopo trattamento con analoghi del cGMP e DDS

Retinitis pigmentosa(RP) is an inherited form of retinal degeneration characterized by a primary degeneration of rod photoreceptors followed by the loss of cone photoreceptors. Mutations in several genes linked to the disease often cause increased levels of guanosine-3’,5’-cyclicmonophosphate (cGMP) and calcium ion influxes, which trigger a series of down-stream processes, eventually leading to photoreceptor cell death. The cGMP-signaling pathway has surfaced as a cell death pathway in hereditary retina degeneration in the last decade and has provided new knowledge on degenerative pathways. However, the underlying down-stream cellular mechanism of this pathway is still not fully understood. The purpose of this project was, first, to develop a new in vitro photoreceptor degenerationmodel for molecular studies of retinitis pigmentosa. The model was based on the 661W cell line, a photoreceptor precursor cell line. Secondly, we aimed at testing the effect of cGMP inhibitory analogues in the novel retinal degeneration model. Thirdly, a new drug delivery system (DDS) based on nanoparticles for delivering hydrophilic cargoes, such as cGMP analogues, was developed and tested on cells. 661W cells were genetically modified to stably express the neural retina leucine zipper (NRL), a rod photoreceptor specific transcription factor. One clone (661W-A11) was selected based on NRL target genes expression. 661W-A11 showed a significant increase in expression of rod-specific genes, but not of cone-specific genes when compared to 661W cells. Western blot confirmed that the rod specific protein levels were increased on 661W-A11 compared to 661W. Based on the knowledge that Phosphodiesterase 6 (PDE6) gene mutations were found in retinitis pigmentosa patients, a protocol to mimic rod degeneration in vitro by treatments with zaprinast was developed. Zaprinast is an inhibitor of phosphodiesterase(PDE), specifically PDE6 and, at less extend, PDE5. The blocking effect of PDE6 activity was demonstrated by decreased viability, increased cell death, increased intracellular cGMP and calcium level, as well as the activation of protein kinase G (PKG) andcalpains, calcium-dependent proteases.Based on this new in vitro system, the effects of previously published neuroprotective drugswere validated. To identify new cell death markers, proteomic analysis was performed to study the phosphorylation protein alterations on this model. Potential markers were analyzed in vitro and verified in a retinal degeneration mouse model. This new in vitro system,661W-A11 cells, will open new molecular systematic studies onRP and will serve for high-throughput drug screening. At last, a new delivery system based on different formulations of nanoparticleswas evaluatedin vitro. Two different formulations of fluorescein labeled nanoparticles were tested and found to be successfully uptaken by 661W cells and also by a retinal pigment epithelium cell line, the ARPE-19 cells. These studies allowed us to define the best nanoparticle formulation to facilitate the entrance of hydrophilic drugs into retinal cells.

La retinite pigmentosa (RP) è una forma ereditaria di degenerazione retinica caratterizzata da morte primaria dei bastoncello seguita dalla perdita dei coni. Le mutazioni in diversi geni legati alla malattia spesso causano un aumento dei livelli di guanosina-3',5'-monofosfato ciclico (cGMP) e afflussi di ioni calcio all’interno dei fotorecettori, che innescano una serie di processi a valle, portando infine alla morte di queste cellule. La via di segnalazione del cGMP è stata correlata alla morte cellulare nella degenerazione ereditaria della retina nell'ultimo decennio e ha fornito nuove conoscenze sulle pathways degenerative. Tuttavia, il meccanismo cellulare a valle di questa via di segnalazione non è ancora pienamente compreso. Lo scopo di questo progetto è, in primo luogo, di sviluppare un nuovo modello di degenerazione dei fotorecettori in vitro per gli studi molecolari della retinite pigmentosa. Il modello è basato sulle cellule 661W, una linea cellulare di precursori dei fotorecettori. In secondo luogo, abbiamo voluto testare l'effetto degli inibitori analoghi del cGMP nel nuovo modello di degenerazione retinica in vitro. In terzo luogo, abbiamo testato un nuovo sistema di drug delivery (DDS) basato su nanoparticelle per la consegna di carichi idrofili, come gli analoghi del cGMP. Questo sistema è stato sviluppato e testato in vitro. Le cellule 661W sono state geneticamente modificate per esprimere stabilmente il gene Neural Retina Leucine-zipper (NRL), un fattore di trascrizione specifico dei bastoncelli. Il clone (661W-A11) è stato selezionato in base all'espressione dei geni target di NRL, ha mostrato un aumento significativo nell’espressione dei geni bastoncello-specifici mentre i geni cono-specifici non hanno mostrato alcuna variazione rispetto alle cellule 661W. Mediante Western blot abbiamo confermato che l’espressione di proteine specifiche per i bastoncelli era aumentata nel clone 661W-A11 rispetto alle 661W. Una mutazione ritrovata in pazienti con retinite pigmentosa coinvolge il gene della fosfodiesterasi 6 (PDE6), sulla base di questa conoscenza è stato sviluppato un protocollo per simulare la degenerazione dei fotorecettori in vitro mediante trattamento con Zaprinast. Questo composto è un inibitore delle fosfodiesterasi (PDE), in particolare della PDE6 e, in misura minore, della PDE5. Il blocco dell'attività della PDE6 è stato dimostrato dalla diminuzione della vitalità e concomitante aumento della morte cellulare, dall'aumento dei livelli intracellulari di cGMP e di calcio, dall'attivazione della proteina chinasi G (PKG) e delle proteasi dipendenti dal calcio, le calpaine. Su questo nuovo sistema in vitro, sono stati convalidati gli effetti dei farmaci con azione neuroprotettiva precedentemente pubblicati. Allo scopo di identificare nuovi marcatori di morte cellulare abbiamo eseguito un analisi proteomica per studiare le alterazioni nello stato di fosforilazione delle proteine su questo modello. I potenziali marcatori sono stati analizzati in vitro e verificati in un modello murino di degenerazione retinica. Questo nuovo sistema in vitro (le cellule 661W-A11) permetterà nuovi studi molecolari sistematici sulla RP e servirà per high-throughput screening di farmaci. Infine, è stato valutato in vitro un nuovo sistema di drug delivery basato su diverse formulazioni di nanoparticelle. Due di queste formulazioni marcate con fluoresceina sono risultate internalizzate con successo dalle cellule 661W e da una linea cellulare di epitelio retinico, le cellule ARPE-19. Questi studi ci hanno permesso di definire la migliore formulazione di nanoparticelle per facilitare l'ingresso di farmaci idrofilici nelle cellule retiniche.