Variazioni di Espressione Genica nei Fotorecettori Durante La Degenerazione

Retinitis Pigmentosa (RP) is a genetic disorder characterized by progressive vision loss due to the degeneration of photoreceptors. More than 100 different genes have been linked to RP, and the high genetic heterogeneity hampers the development of treatments to the cure of this disabling disease. A more profound elucidation at the molecular level of the mechanisms underlying the progression of the disease is needed for the development of new therapeutic approaches. This study focused on transcriptional changes during rod photoreceptor degeneration to understand disease mechanisms and find possible therapeutic targets. To gain insights into rod photoreceptor degeneration, we developed a new in vitro model based on the 661W cell line that mimics the PDE6 gene loss of function mutation in RP patients and related animal models. The cell model relies on the treatment of the cell line with zaprinast, a PDE6 inhibitor, and we compared by RNAseq analysis cell exposed to zaprinast versus not treated cells. We successfully identified differentially expressed genes in response to PDE6 inhibition, especially related to cholesterol biosynthesis and metabolism. Several gene changes linked to cholesterol biosynthesis and metabolism have been validated by Real-time qPCR in the cell system. Confirmation of the relevance of the identified genes in retinal degeneration was performed in relevant animal models of RP. In conclusion, the primary degeneration starts in the rod photoreceptors that are post-mitotic neurons. We developed a new in vitro system to mimic rod photoreceptor degeneration, a fundamental tool for future studies enabling molecular studies on cell death mechanisms. Thanks to the new cell system, we analyzed gene expression changes during degeneration. We found that cholesterol biosynthesis and metabolism pathways might have a crucial role in rod photoreceptor loss. Validation of the genes on the animal models shows that the mutations causing RP can trigger an imbalance in cholesterol pathways. We suggest that the cholesterol pathways can be a new target for the development of new therapeutic approaches.

La retinite pigmentosa (RP) è una malattia genetica caratterizzata da una perdita progressiva della vista dovuta alla degenerazione dei fotorecettori. Più di 100 geni diversi sono stati correlati alla RP e l'elevata eterogeneità genetica ostacola lo sviluppo di trattamenti per la cura di questa malattia invalidante. Per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è necessaria un'elucidazione più profonda a livello molecolare dei meccanismi alla base della progressione della malattia. Questo studio si è concentrato sui cambiamenti trascrizionali che avvengono durante la degenerazione dei bastoncelli al fine di comprendere i meccanismi della malattia e trovare possibili bersagli terapeutici. Per investigare la degenerazione dei bastoncelli, abbiamo sviluppato un nuovo modello in vitro basato sulla linea cellulare 661W che simula la mutazione di perdita di funzione del gene PDE6 nei pazienti RP e nei modelli animali correlati. Questo modello si basa sul trattamento della linea cellulare con zaprinast, un inibitore della PDE6. Abbiamo poi confrontato le cellule esposte a zaprinast rispetto a quelle non trattate tramite analisi RNAseq e sono stati identificati con successo i geni differenzialmente espressi in risposta all'inibizione della PDE6. Tra questi sono emersi, in particolare, geni legati alla pathway del colesterolo. Diversi cambiamenti genici legati alla biosintesi e al metabolismo del colesterolo sono stati convalidati nel sistema cellulare da analisi qPCR. È stata confermata la rilevanza dei geni identificati nella degenerazione retinica tramite analisi in rilevanti modelli animali di RP. In conclusione, la degenerazione dei fotorecettori inizia nei bastoncelli, i quali sono neuroni post-mitotici. Il nuovo sistema in vitro che abbiamo sviluppato per mimare la degenerazione è uno strumento fondamentale per le analisi future e consenteirà studi molecolari sui meccanismi di morte cellulare degli stessi. Grazie a questo nuovo sistema, abbiamo analizzato i cambiamenti di espressione genica durante la degenerazione ed abbiamo scoperto che le vie della biosintesi del colesterolo e del metabolismo potrebbero avere un ruolo cruciale nella perdita dei bastoncelli. La conferma delle variazioni geniche sui modelli animali mostra che le mutazioni che causano la RP possono innescare uno squilibrio nelle vie del colesterolo suggerendo che possano essere un nuovo bersaglio per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.