AZIONE DEI LISOSFINGOLIPIDI E DELLE GONADOTROPINE COME DETERMINANTI DELLA REGOLAZIONE ENDOCRINA DEL FOLLICOLO OVARICO

Sphingosine-1 phosphate (S1P) is a lysosphingolipid present in the ovarian follicular fluid together with glycoprotein hormone gonadotropins. Luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) are necessary to ensure steroidogenesis, gametogenesis and reproduction. Human chorionic gonadotropin (hCG) acts during pregnancy via the same receptor for LH, the LHCGR, to stimulate progesterone production by the corpus luteum and maintaining pregnancy. In addition, gonadotropins are growth and differentiation factors, modulating cell proliferation, survival and apoptosis. Both S1P and gonadotropins exert their physiological functions by binding cognate G protein-coupled receptors (GPCRs). At nanomolar concentrations, S1P binds and activates five specific receptors, known as S1P1-5, modulating different signaling pathways. S1P1 and S1P3 are highly expressed in human primary granulosa lutein cells (hGLC). This study aims to characterize the role of S1P- and gonadotropins-induced signaling in determining ovarian follicle development in vitro. To this purpose were used human granulosa, cell lines stably expressing FSHR and LHCGR under the control of an inducible promoter, treated with gonadotropins and S1P. S1PR1 heterodimerization to LHCGR/FSHR and GPER and the kinetics of LH- and hCG-mediated G proteins and β-arrestin 2 coupling to LHCGR were evaluated, such as the activation of related second messengers and kinases, and the role of gonadotropins-induced LHCGR internalization in vitro. hGLC and hGL5 cells were treated with a fixed dose (0.1 μM) of S1P, or by S1P1- and S1P3-specific agonists SEW2871 and CYM5541. In granulosa cells, S1P and, at a lesser extent, SEW2871 and CYM5541, potently induced pCREB. No cAMP production was detected and pCREB activation occurred even in the presence of the PKA inhibitor H-89. Moreover, S1P-dependent pCREB was dampened by MEK inhibitor U0126 and by the L-type Ca2+ channel blocker verapamil. The complete inhibition of pCREB occurred by blocking either S1P2 or S1P3 with the specific receptor antagonists, or under PLC/PI3K depletion. S1P-dependent pCREB induced FOXO1 and EREG, confirming the exclusive role of gonadotropins and interleukins in this process, but did not affect steroidogenesis. The kinetics of LH and hCG-mediated G proteins and β-arrestin 2 coupling to their receptor, and the activation of related second messengers and kinases were evaluated by BRET. hCG induces Gαs-, Gq and β-arrestin 2 coupling to LHCGR more effectively than LH. Under receptor internalization blockade by Dynasore, hCG maintains similar kinetics, but not LH, which needs LHCGR endocytosis for inducing receptor coupling. These data reflect hormone-specific kinetics of downstream effector activation related to G proteins and β-arrestin 2. LH induced a rapid cAMP increase and is more potent than hCG in activating pERK1/2. Interestingly, the kinetic of hCG-induced intracellular Ca2+ increase depends on LHCGR internalization than LH that fails in inducing intracellular Ca2+ increase, consistently with weak Gq recruitment. The interaction between LHCGR and specific markers of endosomes were evaluated to estimate LHCGR internalization mediated by gonadotropins. Indeed, LH is more potent than hCG in promoting LHCGR recycling. This study demonstrated that S1P may induce a cAMP-independent activation of pCREB in granulosa cells, although this is not sufficient to induce progesterone synthesis. S1P-induced FOXO1 and EREG gene expression suggests that the activation of S1P-S1PR axis may cooperate with gonadotropins in modulating follicle development. LHCGR internalization is fundamental for modulating LH- and hCG-specific signals impacting G proteins and β-arrestin 2 coupling, and the downstream signaling cascades.

La sfingosina-1 fosfato (S1P) è un lisosfingolipide presente nel liquido follicolare ovarico insieme alle gonadotropine glicoproteiche. L'ormone luteinizzante (LH) e l'ormone follicolo-stimolante (FSH) sono necessari per garantire la steroidogenesi, la gametogenesi e la riproduzione. La gonadotropina corionica umana (hCG) agisce durante la gravidanza sullo stesso recettore di LH, LHCGR, per stimolare la produzione di progesterone da parte del corpo luteo e mantenere la gravidanza. Inoltre, le gonadotropine sono fattori di crescita e differenziazione, che modulano la proliferazione cellulare, la sopravvivenza e l'apoptosi. Sia S1P che le gonadotropine esercitano le loro funzioni fisiologiche legandosi a recettori accoppiati a proteine G (GPCR). S1P si lega e attiva cinque recettori specifici, S1P1-5, modulando diverse vie di segnalazione. S1P1 e S1P3 sono altamente espressi nelle cellule primarie della granulosa luteina umana (hGLC). Questo studio mira a caratterizzare il ruolo della segnalazione intracellulare indotto da S1P e gonadotropine nel determinare lo sviluppo del follicolo ovarico in vitro. A questo scopo sono state utilizzate granulose umane e linee cellulari che esprimono stabilmente FSHR e LHCGR sotto il controllo di un promotore inducibile. Sono state valutate l’eterodimerizzazione di S1PR1 con LHCGR/FSHR e GPER e la cinetica delle proteine G e il reclutamento della β-arrestina 2 con LHCGR mediate da LH e hCG, così come l'attivazione di secondi messaggeri e l’internalizzazione di LHCGR in vitro. hGLC e hGL5 sono state trattate con dose fissa (0,1 μM) di S1P e con specifici agonisti di S1P1 e S1P3, SEW2871 e CYM5541. Nelle cellule della granulosa, S1P e, in maniera minore, SEW2871 e CYM5541, hanno indotto pCREB. Non è stata rilevata alcuna produzione di cAMP e l'attivazione di pCREB è avvenuta anche in presenza dell'inibitore della PKA H-89. Inoltre, pCREB S1P-dipendente è stata attenuata dall'inibitore di MEK U0126 e da un bloccante dei canali Ca2+ di tipo L, il verapamil. La completa inibizione di pCREB si è verificata bloccando S1P2 o S1P3 con specifici antagonisti. pCREB S1P-dipendente ha indotto l’espressione di FOXO1 ed EREG, confermando il ruolo esclusivo delle gonadotropine e delle interleuchine in questo processo, ma non ha influenzato la steroidogenesi. hCG induce l'accoppiamento Gαs-, Gq e β-arrestin 2 con LHCGR in modo più efficace rispetto a LH. In presenza di Dynasore, un inibitore dell'internalizzazione, hCG mantiene una cinetica simile, ma non LH, che necessita dell'endocitosi di LHCGR per indurre l'accoppiamento del recettore. Questi dati riflettono la cinetica ormone-specifica dell'attivazione dell'effettore a valle correlata alle proteine G e alla β -arrestina 2. LH ha indotto un rapido aumento di cAMP ed è più potente di hCG nell'attivazione di pERK1/2. È interessante notare che la cinetica dell'aumento di Ca2+ intracellulare indotto da hCG dipende dall'internalizzazione di LHCGR rispetto a LH che non riesce a indurre un aumento di Ca2+ intracellulare. È stata valutata l'interazione tra LHCGR e specifici marcatori degli endosomi per studiare l'internalizzazione di LHCGR mediata dalle gonadotropine. LH è più potente di hCG nel promuovere il riciclaggio di LHCGR. Questo studio ha dimostrato che S1P può indurre un'attivazione di pCREB indipendente da cAMP nelle cellule della granulosa, sebbene ciò non sia sufficiente per indurre la sintesi del progesterone. L'espressione genica di FOXO1 ed EREG indotta da S1P suggerisce che l'attivazione dell'asse S1P-S1PR può cooperare con le gonadotropine nel modulare lo sviluppo del follicolo. L'internalizzazione di LHCGR è fondamentale per modulare i segnali specifici di LH e hCG che influenzano le proteine G e l'accoppiamento β -arrestina 2 e le cascate di segnalazione a valle.