ANISAKIS SPP. COME POSSIBILE RISCHIO PER I CONSUMATORI DI PESCE DEL MEDITERRANEO: OTTIMIZZAZIONE DI PROCEDURE ISPETTIVE E BIOMOLECOLARI DI PREVENZIONE

My PhD thesis aimed to investigate the possible risks to Mediterranean consumers related to the presence of Anisakis spp. in fish and fish products of the FAO Zone 37 and adopt prevention procedures based on inspection and molecular techniques. The PhD activity was divided into 3 work packages. In the first work package, I analysed 1104 fish samples belonging to 5 species from markets of Sicily (Southern Italy) for the detection of Anisakis spp. nematodes by visual inspection and a modified chloro-peptic digestion, and their identification by molecular methods. The preliminary analysis of the fish samples showed the presence of 2459 larvae. All the fish species examined showed different prevalence of infestation, with a maximum of 100% in Lepidopus caudatus and a minimum of 4.5% in Sardina pilchardus. About 80% of the larvae examined by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analysis belonged to Anisakis pegreffii species. The seasonal infestation trend of Anisakis was evaluated in all the fish samples examined. The results of the seasonal infestation trend showed a marked connection with the ecological aspects of the fish species examined. The results of this work package could be useful to plan a seasonal fishing strategy aimed at reducing the health risks of consumers related to Anisakis. In the second work package, I assessed the possible presence of Anisakis spp. larvae in aquaculture fish samples. In particular, I examined 151 Dicentrarchus labrax L. samples from farms and fish markets of Sicily (Southern Italy) for Anisakis larvae detection. All the samples were examined by visual inspection and modified chloro-peptic digestion. Two nematode larvae were found in the viscera of only one Dicentrarchus labrax L. sample from a farm located in Greece (FAO 37.3), giving a total prevalence of infestation of 0.7%. The larvae were molecularly identified as Anisakis pegreffii. This is the first report on the presence of Anisakis parasites in farmed Dicentrarchus labrax of Mediterranean Sea, suggesting that the risk of exposure to Anisakis spp. in farmed fish remains very low. In the third work package, I optimized and validated a commercial system based on Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) technique for the sensitive and rapid detection of Anisakis spp. DNA in processed fish products. Processed fish samples experimentally infected with Anisakis spp. larvae and DNA were used for specificity and sensitivity tests. The validation of the LAMP assay gave positive amplification for all the processed fish samples artificially contaminated with Anisakis spp., giving sensitivity values equal to 100%. The specificity tests provided no amplification for other Anisakidae and Raphidascarididae genera and uninfected samples. The limit of detection (LOD) of the LAMP assay proposed was 102 times lower than the real-time PCR method used for comparison purposes. To the best of my knowledge, this is the first report regarding the application of the LAMP assay for the detection of Anisakis spp. in processed fish products. The LAMP assay optimized and validated could be a reliable and convenient tool for the rapid detection of Anisakis DNA in processed fish products, useful in preventing the possible presence of Anisakis-related allergens and safeguarding the health of sensitive consumers.

La mia tesi di dottorato ha avuto lo scopo di indagare sul possibile rischio per i consumatori del Mediterraneo relativo alla presenza di larve di Anisakis spp. in prodotti della pesca della zona FAO 37, ed adottare procedure di prevenzione basate tecniche ispettive e lo sviluppo di metodiche molecolari. L’attività di dottorato è stata suddivisa in 3 work packages. Durante il primo work package ho analizzato 1104 campioni di pesce appartenenti a 5 specie provenienti da mercati ittici della Sicilia per la rilevazione, mediante esami ispettivi (ispezione visiva e digestione cloro-peptica modificata) di nematodi appartenenti al genere Anisakis e la loro successiva identificazione mediante metodi molecolari. Le analisi ispettive preliminari hanno rivelato la presenza di 2459 larve di Anisakis spp. I campioni di pesce esaminati hanno mostrato differenti valori di prevalenza di infestazione, con un massimo del 100% nei campioni di Lepidopus caudatus ed un minimo del 4,5% nei campioni di Sardina pilchardus. Circa l’80% delle larve esaminate attraverso metodo PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) appartenevano alla specie Anisakis pegreffii. Successivamente, è stato analizzato il trend stagionale di infestazione di Anisakis nei campioni esaminati. I risultati hanno mostrato una marcata relazione con gli aspetti ecologici delle specie di pesce esaminati. I dati ottenuti in questo work package si rivelano utili per una possibile pianificazione stagionale dell’attività di pesca al fine di ridurre possibili rischi ai consumatori legati alla presenza di Anisakis spp. Nel secondo work package, ho valutato la possibile presenza di larve di Anisakis spp. i campioni di pesci d’acquacoltura. In particolare ho analizzato 151 campioni di spigola (Dicentrarchus labrax L.), provenienti da mercati ittici della Sicilia, per la ricerca di larve di Anisakis spp. I campioni sono stati analizzati attraverso ispezione visiva e digestione cloro-peptica modificata. Le indagini hanno rilevato la presenza di due larve di Anisakis spp. nei visceri di un solo campione di spigola proveniente da acquacoltura greca (FAO 37.3), determinando una prevalenza di infestazione totale del 0,7%. Le due larve sono state identificate molecolarmente come Anisakis pegreffii. I risultati ottenuti rivelano in primo report sulla presenza di parassiti Anisakis spp. in pesci di allevamento del Mediterraneo, confermando comunque un basso rischio d’esposizione ad Anisakis per questi prodotti. Nel work package finale ho ottimizzato e validato un sistema commerciale basato sul metodo LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) per la determinazione rapida e sensibile della presenza di DNA di Anisakis spp. in prodotti della pesca trasformati. Sono stati utilizzati campioni infestati sperimentalmente da DNA e larve di Anisakidae e Raphidascarididae per testare la specificità e sensibilità del metodo. Il processo di validazione ha determinato una positività per tutti i campioni infestati con Anisakis spp., mostrando valori di sensibilità pari al 100%. Il test di specificità non ha determinato alcun segnale di amplificazione per altri parassiti Anisakidi e Raphidascarididi e per campioni non infestati artificialmente. Il limite di rivelabilità del metodo (LOD) ottenuto si è rivelato 100 volte inferiore del metodo di Real-Time PCR usato come confronto. I risultati ottenuti si riferiscono al primo studio sull’applicazione del metodo LAMP per la ricerca di Anisakis spp. nei prodotti della pesca trasformati. Il metodo ottimizzato e validato si rivela un economico ed affidabile strumento di autocontrollo nel prevenire la possibile presenza di allergeni Anisakis-correlati nei prodotti della pesca trasformati, utile alla salvaguardia dei consumatori sensibili.