Analisi genomica e funzionale sui componenti del microbiota intestinale Clostridium ramosum, Escherichia coli e Enterobacteriaceae

Gut microbiota is a collection of bacteria, archaea, and eukarya that inhabits the mammalian gastrointestinal tract. The composition of this microbial community is host specific, it evolves throughout lifetime, and can create an intricate and mutually beneficial relationship with the host (Backhed, 2005; Neish, 2009). Through the years, research interest has been manly focused on the characterization of antibiotic resistance acquisition of virulent clinical Escherichia coli and other Enterobacteriaceae species, whereas strains isolated from healthy subjects have been less studied and mostly investigated only in comparative studies (Johnson et al., 2000; Kudinha et al., 2013; Lee et al., 2019). The first project focused on the deep characterization of a collection of E. coli and other Enterobacteriaceae isolated from fecal samples of 20 healthy volunteers, in order to determine whether the relationship between PFGE genotyping, phylogroups, genetic determinants, and functional features can be established among the isolates. A total of 51 different strains of E. coli were collected. According to Clermont phylogrouping, the 27% of E. coli isolates belonged to B2 phylogroup, the 24% to B1, 14% to F, 14% to A, 10% to D, 8% to E and 4% to C. Within the B2 and F strains, 12 shared pattern of virulence genes associated with clinical uropathogenic strains. A total of 49 out of 51 strains were sensitive to all the tested antibiotics. From the same fecal samples it has been possible to collect 34 different Enterobacteriaceae strains belonging to 12 different species: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter hormaechei, E. ludwigii, E. cloacae, Citrobacter freudnii, C. amalonaticus, Hafnia alvei, Cronobacter sakazakii, Morganella morganii, Serratia liquefaciens, and Raoultella planticola. A total of 6 out of 10 K. pneumoniae strains were positive for mrkD, ycfM, kpn, and entB genes that encode for different fimbrial structures and siderophores. The 88% of Enterobacteriaceae strains isolated were able to produce biofilm in M9Glu minimal medium; the 62% was able to produce cellulose and the 58% to synthetize curli fibers. These features are consistent with the profile of clinical isolates. Strains of E. coli and of other Enterobacteriaceae potentially act like pathogens based on the presence of virulence genes, capacity of biofilm production, and transfer of genetic material through conjugation, albeit they innocuously inhabit the gut of healthy subjects. It is possible that they occasionally act as etiologic agents of extra-intestinal infections. It is relevant that most E. coli strains are susceptible to a wide range of antibiotics. The second project involved the study of Clostridum ramosum, an intestinal bacterium that seems to be involved in obesity development for its role in the modulation of serotonin availability in the intestinal epithelium that is responsible of an increased nutrient absorption (Mandić et al., 2018). The presence of C. ramosum was investigated in mice strains prone to obesity and in mice subjected to a high-fat diet, in order to identify endogenous strains. From a total of 85 mice, it was possible to isolate only 3 strains of endogenous C. ramosum. In spite of the obesity of the mice analysed, the isolation of C. ramosum was not so frequent as hypothesized. Probably the bacterium itself was not involved in the exacerbation of obesity in those mice.

Il microbiota intestinale è un insieme di batteri, archea ed eucarioti che risiedono nel tratto intestinale dei mammiferi. La composizione di questa varia comunità microbica è specifica per ogni individuo e crea una complessa e mutualistica relazione con esso evolvendosi durante l’arco della vita (Backhed, 2005; Neish, 2009). Ad oggi, la ricerca su Escherichia coli e sulle altre specie di Enterobatteriacee si è principalmente focalizzata sullo studio della acquisizione di antibiotico-resistenze in ceppi coinvolti in infezioni cliniche conclamate. Al contrario, i ceppi isolati da soggetti sani sono poco caratterizzati, se non in studi comparativi (Johnson et al., 2000; Kudinha et al., 2013; Lee et al., 2019). Il primo progetto ha riguardato la caratterizzazione di ceppi di E. coli e di altre specie di Enterobatteriacee isolati dai campioni fecali di 20 soggetti sani, con lo scopo di comprendere se esistono delle correlazioni tra il genotipo attribuito dalla PFGE, il filogruppo, i determinanti genici di virulenza e le strutture funzionali potenzialmente coinvolte nella colonizzazione e nella virulenza. Dai 20 volontari sani sono stati isolati 51 ceppi di E. coli, dei quali il 27% appartiene al filogruppo B2, il 24% al B1, il 14% all’F, il 14% all’A, il 10% al D, l’8% all’E e il 4% al C. Un totale di12 ceppi appartenenti ai filogruppi B2 e F presentano determinanti genici di virulenza caratteristici di ceppi di E. coli uropatogeni. Dei 51 ceppi testati, solo 2 sono resistenti ai comuni antibiotici usati per il trattamento delle infezioni da Gram-negativi. Dagli stessi campioni fecali dei 20 soggetti sani è stato possibile isolare 34 diversi biotipi di Enterobatteriacee appartenenti a 12 specie: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter hormaechei, E. ludwigii, E. cloacae, Citrobacter freudnii, C. amalonaticus, Hafnia alvei, Cronobacter sakazakii, Morganella morganii, Serratia liquefaciens e Raoultella planticola. Dei 10 ceppi di K. pneumoniae testati per specifici geni di virulenza, 6 presentano mrkD, ycfM, kpn, e entB, che codificano per diverse strutture delle fimbrie e per un sideroforo. L’88% delle Enterobatteriacee isolate sono capaci di produrre biofilm su terreno minimo M9glu, il 62% di loro producono cellulosa e il 58% sono in grado di sintetizzare curli. Sulla base di queste caratteristiche gli isolati sono simili a ceppi patogeni di interesse clinico. Lo studio ha messo in evidenza come tra i ceppi di E. coli e delle altre specie di Enterobatteriacee isolati dalle feci di soggetti sani, e che come tali risiedono in modo innocuo nel tratto gastrointestinale, siano stati identificati ceppi che potenzialmente potrebbero comportarsi da agenti eziologici di infezioni extra-intestinali. Infatti, presentano numerosi geni di virulenza, sono capaci di produrre biofilm e di trasferire materiale genetico tramite coniugazione. La maggior parte dei ceppi di E. coli isolati però, è risultata suscettibile a tutti gli antibiotici testati. Il secondo progetto ha riguardato lo studio di Clostridium ramosum, un batterio che sembra partecipare all’insorgenza dell’obesità a causa del suo ruolo di modulatore della disponibilità di serotonina nell’epitelio intestinale, che come conseguenza aumenta i livelli di assorbimento dei nutrienti (Mandić et al., 2018). La presenza di C. ramosum è stata analizzata nelle feci di topi soggetti ad una dieta ricca di grassi o obesi, al fine di individuarne i ceppi endogeni. Da un totale di 85 topi, è stato possibile isolare solo 3 ceppi endogeni di C. ramsoum. Nonostante l’obesità dei topi oggetto di studio non è stato possibile isolarne così frequentemente quanto ipotizzato. Probabilmente, in questi topi C. ramosum non ha un ruolo determinante nell’insorgenza dell’obesità.