Inibitori dell’interazione proteina-proteina per superare la resistenza farmacologica in diversi tipi di cancro: ottimizzazione del lead E7, un inbitore dissociativo della Timidilato sintasi umana

Human thymidylate synthase (hTS) plays a fundamental role in the synthesis of DNA, essential for cell survival. hTS is involved in the folate pathways, specifically in the de novo pyrimidine biosynthesis. Protein structure and functions are intimately correlated for the explication of the enzymatic activity. Despite the enormous amount of work reported in the literature, hTS structure-function relationships features are still unclear, especially the different conformations and monomers/dimer equilibrium of this obligate homodimeric protein and its role in protein expression regulation. The above-mentioned concept was largely investigated during the execution of the AIRC project entitled “Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer” that was also in part the topic of my PhD thesis. Additionally, my project was included in the PhD regional program dedicated to ONCOPENTA1. hTS is the most renowned anticancer drug target. Over 3300 clinical trials have been performed since the early sixties, some of them providing anti-TS clinical drugs as Fluorouracil (FU), Pemetrexed and Raltitrexed that are adopted in different cancer types such as colorectal cancer (CRC) and recently in ovarian cancer (OC). All the mentioned drugs, after prolonged use, cause drug resistance that makes the drug ineffective. In OC, cross-resistance with platinum drugs is also observed. One of the main resistance mechanisms is the overexpression of hTS. The development of new drugs able to overcome drug resistance effects due to high TS protein level would be an important achievement. This requires a change of strategy and the discovery of new mechanisms of inhibition that should unpair the protein inhibition with respect to its TSmRNA regulation. Currently, TS-targeting drugs bind at the catalytic-pocket and mostly resemble the protein substrates. Allosteric inhibitors (non-substrate analogues) binding at the protein dimeric interface may alter the dimer/monomer equilibrium by increasing the monomer form amount thus triggering cellular pathways modulation previously unexplored. The first compound with the mentioned features (E7) was recently identified. However a lead optimization work is necessary to optimize the compound properties. The specific aim of my thesis work is the design and development of novel dissociative inhibitors stemming from the E7 lead. The new compounds should induce a perturbation in the dimer-monomer equilibrium in favour of the monomeric form thus, inhibiting the catalytic function, preserving the regulatory activity and consequently reduce the development of drug resistance. To achieve this aim, I have synthesized more than 40 compounds that were tested and analyzed using enzyme kinetic inhibition studies and fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays that revealed the capability of these compounds to disrupt the dimeric form of hTS. To gain evidence that our compounds determine hTS dimer disrupters engagement in cells, I have designed and synthesized compounds with fluorescence probe that we resorted in fluorescence microscopy. Moreover, I have developed a scale-up methodology for chemical processes and preparative chiral HPLC resolution to obtain the in vivo data. My lead optimization work provided a compound, AIC-C37, that showed higher solubility and efficacy with respect to E7 and Fluorouracil and interesting anchoring point for in vitro and in vivo mechanism of action studies. 1 Progetto (ONCOPENTA): Oncologia di Precisione e Nuove Terapie Antitumorali. Sviluppo di inibitori dell’interazione protein-proteina contro la farmaco-resistenza nei sarcomi e carcinomi

La timidilato sintasi umana (hTS) svolge un ruolo fondamentale nella sintesi del DNA, essenziale per la sopravvivenza cellulare. L’hTS è coinvolta nel percorso dei folati, nello specifico nella biosintesi ex novo delle pirimidine. La struttura della proteina e le sue funzioni sono strettamente correlate per l’esplicazione dell’attività enzimatica. Nonostante il quantitativo di lavori riportati in letteratura, le caratteristiche delle relazioni struttura-funzione dell’ hTS non sono ancora chiare, in particolare le diverse conformazioni e le forme di equilibrio monomero/dimero di questa proteina omodimerica obbligata e il suo ruolo nella regolazione dell’espressione genica. Il concetto espresso precedentemente è stato ampiamente investigato durante il progetto AIRC intitolato “Inibitori dell’interazione proteina-proteina della timidilato sintasi contro il cancro al colon retto”, che è stato parte del mio progetto di dottorato. Inoltre, il mio progetto è incluso nel programma del PhD regionale ONCOPENTA1. hTS è tra i bersagli più studiati per la progettazione di farmaci antitumorali. Oltre 3300 studi clinici sono stati condotti dall'inizio degli anni sessanta, alcuni dei quali hanno portato alla scoperta di farmaci anti-TS come il Fluorouracile (FU), Pemetrexed e Raltitrexed che sono utilizzati in diversi tipi di tumori come quello del colon-retto (CRC), e recentemente, dell’ovarico (OC). I farmaci citati, dopo un uso prolungato determinano resistenza farmacologica rendendoli inefficaci. Inoltre nell’ OC è presente la resistenza incrociata per l’utilizzo di farmaci al platino. Uno dei principali meccanismi di tale resistenza è la sovraespressione dell’hTS. Un risultato importante è l’ottenimento di nuovi farmaci abili di superare l’effetto della resistenza farmacologica indotta da elevati livelli della proteina TS. Pertanto, l'inibizione proteica rispetto alla sua regolazione TSmRNA richiede una strategia alternativa e la scoperta di un nuovo meccanismo di inibizione. Attualmente, i farmaci anti-TS sono inibitori che si legano nella tasca catalitica, mimando i substrati. Gli inibitori allosterici (non substrati analoghi), legandosi all’interfaccia dimerica della proteina, possono alterare l’equilibrio dimero\monomero con l’incremento della forma monomerica, ed innescando così la modulazione delle vie cellulari, ad ora inesplorate. E7 è stato il primo composto recentemente individuato con tali caratteristica ma necessita di un lavoro di ottimizzazione per migliorare le proprietà farmacologiche. Lo scopo principale della tesi è la progettazione e lo sviluppo di nuovi inibitori, analoghi di E7, che alterano l’equilibrio dimerico della proteina. I nuovi composti dovrebbero indurre una perturbazione dell’ equilibrio dimero monomero in favore della forma monomerica, inibendo la funzione catalitica, preservando l’attività regolatoria e conseguentemente la riduzione della resistenza farmacologica. Per raggiungere tali obiettivi, ho sintetizzato più di 40 composti che sono stati testati ed analizzati con studi di inibizione enzimatica e di FRET, la quale rileva la capacità di questi composti di ridurre la forma dimerica della TS. Per stabilire se i nostri composti determinano la separazione del dimero a livello cellulare, ho progettato e sintetizzato composti legati a sonde fluorescenti. Inoltre, ho sviluppato una nuova sintesi per la produzione del composto in grande quantità e la risoluzione enantiomerica tramite HPLC preparativa chirale per ottenere i dati in vivo del nostro composto migliore. Il mio lavoro di ottimizzazione ha portato all’ottenimento del composto AIC-C37 che presenta una migliore attività biologica e solubilità (rispetto ad E7 e FU) ed un interessante punto di collegamento molecolare per studiare il meccanismo in vivo.