Enzymes have been used in many productive sectors for more than a hundred years. However, over the last 50 years, since the advent of recombinant DNA technologies, they have found a much wider and diverse range of applications, spanning across virtually any kind of human activities. In particular, because of their remarkable properties, enzymes have become the major choice for medical diagnostic applications and are being increasingly utilized for both the detection and the treatment of a broad variety of diseases. The purpose of this thesis is to study and exploit the high substrate specificity of a very peculiar human PLP-dependent enzyme, named O-phosphoethanolamine phospho-lyase (ETNPPL), for diagnostic applications. The enzyme promotes the irreversible degradation of O-phosphoethanolamine (PEA) to acetaldehyde, phosphate and ammonia. The physico-chemical characterization of ETNPPL reported in the literature suggests a mechanism of action that is very similar to other PLP-dependent enzymes, implying that the same residues are present in the active site. However, a structural characterization of human ETNPPL has not yet been reported in the literature. The first issue that I addressed in this thesis was to obtain the high-resolution 3D-structure of ETNPPL by X-ray crystallography in order to validate the mechanism of action proposed in the literature. To this end, starting from the cloning of the DNA fragment encoding for the human ETNPPL into a suitable expression vector, I expressed and purified the human ETNPPL. After assessing the enzymatic activity of the purified protein sample, I carried out crystallization experiments and I obtained good quality crystals for X-ray data collection. I determined the 3D-structure of ETNPPL at 2.3 Å resolution. Once I have completed the structural characterization of the enzyme and I have fully rationalized its high substrate specificity for phosphoethanolamine (PEA), its natural substrate, I set out to investigate one of its possible practical applications by designing and working towards the development of a biosensor for the selective detection of PEA in the urine. PEA levels in the urine of prostate cancer patients have been reported to decrease relative to healthy patients. Therefore, an ETNPPL-based assay for the measurement of PEA concentrations would be most useful in prostate cancer screening. To date, the early detection of prostate cancer involves the prostate-specific antigen (PSA) blood test. However, this approach is known to produce high rates of false positive results since increased PSA levels are often found in men with benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis and prostate injury. For this reason, the need for new biomarkers that can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with standard PSA tests appears evident. A method for the rapid and quantitative detection of this analyte would be of relevance for the diagnosis of such disease and, at the same time, would represent a potent validation tool of PEA as a prostate cancer biomarker.

Le prime applicazioni industriali di enzimi risalgono a più di cento anni fa. Tuttavia, è solo negli ultimi 50 anni che, grazie all’avvento delle tecnologie del DNA ricombinante, il loro impiego ha subito una forte crescita in moltissimi settori industriali. In particolar modo, grazie alle loro interessanti proprietà, gli enzimi stanno trovando grande impiego in campo medico, principalmente nella diagnostica e nel trattamento di un sempre crescente numero di patologie. Lo scopo di questa tesi è quello di studiare l’elevata specificità di substrato di un enzima umano PLP-dipendente, detto O-fosfoetanolamina fosfo-liasi (ETNPPL), per lo sviluppo di un’applicazione diagnostica. ETNPPL catalizza una reazione irreversibile in cui si ha la degradazione della fosfoetanolamina (PEA) con formazione di acetaldeide, ioni fosfato e ammonio. La caratterizzazione fisico-chimica di questo enzima, già riportata in letteratura, suggerisce un meccanismo di azione simile a quello di altri enzimi PLP-dipendenti. Tale ipotesi implica che nel sito attivo dell’enzima siano presenti gli stessi residui aminoacidici. Tuttavia, ad oggi, una conferma di questa ipotesi mediante caratterizzazione strutturale non è stata ancora ottenuta. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di ottenere la struttura tridimensionale ad alta risoluzione dell’enzima umano ETNPPL attraverso cristallografia ai raggi-X. Per questo scopo, è stato effettuato il clonaggio del gene codificante per la ETNPPL umana all’interno di un vettore che ha permesso l’espressione eterologa dell’enzima in cellule di E.coli. L’enzima così prodotto è stato purificato mediante cromatografia in fase liquida e, una volta testata la sua attività enzimatica, è stato cristallizzato per gli esperimenti di cristallografia ai raggi-X. La struttura 3D dell’enzima ETNPPL è stata infine determinata con una risoluzione di 2.3 Å. Una volta razionalizzata l’elevata specificità dell’enzima per il suo substrato naturale, la fosfo- etanolamina (PEA), si è deciso di studiarne un’applicazione pratica tramite la progettazione e lo sviluppo di un biosensore in grado di rilevare selettivamente la PEA in campioni di urina. L’analisi si colloca in un più ampio contesto legato allo screening del tumore alla prostata che, ad oggi, viene effettuato utilizzando principalmente il test della PSA. Dal momento che livelli elevati di PSA possono essere rinvenuti anche in presenza di altre patologie, il test della PSA comporta un alto numero di falsi positivi. Per questo motivo appare evidente la necessità di ricercare nuovi biomarkers del tumore alla prostata, che siano in grado di aumentare l’attendibilità dei risultati dello screening, eventualmente anche supportando il test della PSA. Recentemente la PEA è stata indicata come possibile biomarker del tumore alla prostata. I livelli di PEA nelle urine di pazienti affetti da questo tumore risultano infatti significativamente inferiori rispetto a quelli delle persone sane. Di conseguenza, un metodo rapido e quantitativo per l’identificazione di PEA nelle urine, basato sull’affinità dell’enzima ETNPPL per il suo substrato naturale, potrebbe essere particolarmente rilevante per la diagnosi della malattia e, al tempo stesso potrebbe essere utilizzato come metodo per validare la PEA come biomarker del tumore alla prostata.

O-fosfoetanolamina fosfo-liasi: dalla caratterizzazione strutturale ad applicazioni biomediche / Chiara Vettraino , 2020 Mar 13. 32. ciclo, Anno Accademico 2018/2019.

O-fosfoetanolamina fosfo-liasi: dalla caratterizzazione strutturale ad applicazioni biomediche

VETTRAINO, CHIARA
2020

Abstract

Enzymes have been used in many productive sectors for more than a hundred years. However, over the last 50 years, since the advent of recombinant DNA technologies, they have found a much wider and diverse range of applications, spanning across virtually any kind of human activities. In particular, because of their remarkable properties, enzymes have become the major choice for medical diagnostic applications and are being increasingly utilized for both the detection and the treatment of a broad variety of diseases. The purpose of this thesis is to study and exploit the high substrate specificity of a very peculiar human PLP-dependent enzyme, named O-phosphoethanolamine phospho-lyase (ETNPPL), for diagnostic applications. The enzyme promotes the irreversible degradation of O-phosphoethanolamine (PEA) to acetaldehyde, phosphate and ammonia. The physico-chemical characterization of ETNPPL reported in the literature suggests a mechanism of action that is very similar to other PLP-dependent enzymes, implying that the same residues are present in the active site. However, a structural characterization of human ETNPPL has not yet been reported in the literature. The first issue that I addressed in this thesis was to obtain the high-resolution 3D-structure of ETNPPL by X-ray crystallography in order to validate the mechanism of action proposed in the literature. To this end, starting from the cloning of the DNA fragment encoding for the human ETNPPL into a suitable expression vector, I expressed and purified the human ETNPPL. After assessing the enzymatic activity of the purified protein sample, I carried out crystallization experiments and I obtained good quality crystals for X-ray data collection. I determined the 3D-structure of ETNPPL at 2.3 Å resolution. Once I have completed the structural characterization of the enzyme and I have fully rationalized its high substrate specificity for phosphoethanolamine (PEA), its natural substrate, I set out to investigate one of its possible practical applications by designing and working towards the development of a biosensor for the selective detection of PEA in the urine. PEA levels in the urine of prostate cancer patients have been reported to decrease relative to healthy patients. Therefore, an ETNPPL-based assay for the measurement of PEA concentrations would be most useful in prostate cancer screening. To date, the early detection of prostate cancer involves the prostate-specific antigen (PSA) blood test. However, this approach is known to produce high rates of false positive results since increased PSA levels are often found in men with benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis and prostate injury. For this reason, the need for new biomarkers that can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with standard PSA tests appears evident. A method for the rapid and quantitative detection of this analyte would be of relevance for the diagnosis of such disease and, at the same time, would represent a potent validation tool of PEA as a prostate cancer biomarker.
O-phosphoethanolamine phospho-lyase: from structural characterization to biomedical applications
13-mar-2020
BORTOLOTTI, Carlo Augusto
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