Bone and muscle have been recognized as endocrine organs since they produce and secrete “hormone like factors” that can mutually influence each other and other tissues, giving rise to a “bone-muscle crosstalk”. In our study, we made use of a myogenic (C2C12 cells) and an osteogenic (2T3 cells) cell line to investigate the effects of muscle cell-produced factors on the maturation process of osteoblasts. We found that the myogenic medium has inhibitory effects on bone cells differentiation: this datum prompted us to analyze the content of myoblast/myotube-conditioned media and, by so doing, we identified Sclerostin as one of the myokines produced by muscle cells. Sclerostin is a secreted glycoprotein mainly expressed by bone/cartilage cells and is considered a negative regulator of bone growth due to its role as an antagonist of the Wnt/β-catenin pathway. It has also been found to inhibit the early stages of in vitro osteoblasts-to-preosteocytes differentiation. Given the inhibitory role of this protein in bone, we analyzed deeper the expression of Sclerostin by muscle cells and how it affects bone formation and homeostasis. Firstly, we characterized and quantified Sclerostin synthesis by a murine myoblast cell line (C2C12) by Western Blot, Real Time PCR, Immunofluorescence and ELISA assay. Next, we moved on to the in vivo muscular production of Sclerostin. We examined its synthesis in muscles of differently aged mice: young (6 weeks), adult (5 months) and old (18 months). For each age we studied: i) a muscle composed of fast/phasic or glycolytic fibers (Gastrocnemius); ii) a muscle composed of slow/tonic or oxidative fibers (Soleus), which are subjected to mechanical loading and movement; iii) a back muscle (Latissimus dorsi), less loaded according to the phasic activity of the limbs, to check if the type of muscular work/load affects the Sclerostin production. Also, a muscle of the upper limb (Triceps brachii) was isolated, to compare it with the muscles of the lower limb. Finally, we transiently expressed Sclerostin in Quadriceps femoris, Gastrocnemius and Tibialis anterior muscles of young mice (2 weeks of age) via electroporation of a plasmid containing the SOST gene, in order to investigate the effects of a muscle-specific overproduction of the protein. This experiment was aimed at evaluating the paracrine effects of muscular Sclerostin on the adjacent skeletal segments and its endocrine action on the whole skeleton.

L'osso e il muscolo striato sono stati riconosciuti come organi endocrini poiché producono e secernono "fattori simil-ormonali" attraverso i quali possono influenzarsi a vicenda ed agire su altri tessuti, dando vita ad un "crosstalk muscolo-scheletrico". Nel nostro studio, abbiamo utilizzato una linea cellulare miogenica (cellule C2C12) ed una osteogenica (cellule 2T3) per studiare gli effetti dei fattori prodotti dalle cellule muscolari sul processo di maturazione degli osteoblasti. Abbiamo evidenziato che il medium miogenico ha effetti inibitori sulla differenziazione degli osteoblasti: questo dato ci ha spinto ad analizzare il contenuto dei terreni condizionati da mioblasti/miotubi e, così facendo, abbiamo identificato Sclerostina come una delle miochine prodotte dalle cellule muscolari. Sclerostina è una glicoproteina secreta espressa principalmente dalle cellule ossee/cartilaginee ed è considerata un regolatore negativo della crescita ossea poiché agisce come antagonista della via di segnalazione Wnt/β-catenina. Si è scoperto anche che inibisce le prime fasi del differenziamento degli osteoblasti in pre-osteociti in vitro. Dato il ruolo inibitorio di questa proteina nell'osso, abbiamo approfondito l’analisi dell'espressione di Sclerostina da parte delle cellule muscolari e come essa possa influenzare la formazione e l'omeostasi dell’osso. Inizialmente, si è caratterizzata e quantificata la sintesi di Sclerostina in mioblasti murini (C2C12) tramite Western Blot, Real Time PCR, Immunofluorescenza ed ELISA. Successivamente, si è passati all’analisi della produzione di Sclerostina muscolare in vivo. Abbiamo esaminato la sua sintesi in muscoli di topi di età diversa: giovani (6 settimane), adulti (5 mesi) e anziani (18 mesi). Per ogni età abbiamo studiato: i) un muscolo composto da fibre fasiche o glicolitiche (Gastrocnemio); ii) un muscolo composto da fibre toniche o ossidative (Soleo), che sono soggette al carico meccanico e al movimento; iii) un muscolo dorsale (Latissimus dorsi), con meno carico in ragione dell'attività fasica degli arti, per verificare se il tipo di lavoro muscolare/carico influisce sulla produzione di Sclerostina. Inoltre, è stato isolato un muscolo dell'arto superiore (Triceps brachii), per confrontarlo con i muscoli dell'arto inferiore. Infine, allo scopo di delineare il ruolo di Sclerostina muscolare abbiamo espresso in modo transiente la proteina nei seguenti muscoli: quadricipite femorale, gastrocnemio e tibiale anteriore di giovani topi (2 settimane di età) attraverso l'elettroporazione di un plasmide contenente il gene SOST. Questo esperimento mira a valutare sia gli effetti paracrini della Sclerostina muscolare sui segmenti scheletrici adiacenti sia la sua azione endocrina sull'intero scheletro.

Crosstalk tra muscolo e osso: identificazione di Sclerostina come una presunta nuova miochina / Maria Sara Magaro' , 2020 Mar 13. 32. ciclo, Anno Accademico 2018/2019.

Crosstalk tra muscolo e osso: identificazione di Sclerostina come una presunta nuova miochina

MAGARO', MARIA SARA
2020

Abstract

Bone and muscle have been recognized as endocrine organs since they produce and secrete “hormone like factors” that can mutually influence each other and other tissues, giving rise to a “bone-muscle crosstalk”. In our study, we made use of a myogenic (C2C12 cells) and an osteogenic (2T3 cells) cell line to investigate the effects of muscle cell-produced factors on the maturation process of osteoblasts. We found that the myogenic medium has inhibitory effects on bone cells differentiation: this datum prompted us to analyze the content of myoblast/myotube-conditioned media and, by so doing, we identified Sclerostin as one of the myokines produced by muscle cells. Sclerostin is a secreted glycoprotein mainly expressed by bone/cartilage cells and is considered a negative regulator of bone growth due to its role as an antagonist of the Wnt/β-catenin pathway. It has also been found to inhibit the early stages of in vitro osteoblasts-to-preosteocytes differentiation. Given the inhibitory role of this protein in bone, we analyzed deeper the expression of Sclerostin by muscle cells and how it affects bone formation and homeostasis. Firstly, we characterized and quantified Sclerostin synthesis by a murine myoblast cell line (C2C12) by Western Blot, Real Time PCR, Immunofluorescence and ELISA assay. Next, we moved on to the in vivo muscular production of Sclerostin. We examined its synthesis in muscles of differently aged mice: young (6 weeks), adult (5 months) and old (18 months). For each age we studied: i) a muscle composed of fast/phasic or glycolytic fibers (Gastrocnemius); ii) a muscle composed of slow/tonic or oxidative fibers (Soleus), which are subjected to mechanical loading and movement; iii) a back muscle (Latissimus dorsi), less loaded according to the phasic activity of the limbs, to check if the type of muscular work/load affects the Sclerostin production. Also, a muscle of the upper limb (Triceps brachii) was isolated, to compare it with the muscles of the lower limb. Finally, we transiently expressed Sclerostin in Quadriceps femoris, Gastrocnemius and Tibialis anterior muscles of young mice (2 weeks of age) via electroporation of a plasmid containing the SOST gene, in order to investigate the effects of a muscle-specific overproduction of the protein. This experiment was aimed at evaluating the paracrine effects of muscular Sclerostin on the adjacent skeletal segments and its endocrine action on the whole skeleton.
Muscle-to-bone crosstalk: identification of Sclerostin as a putative new myokine
13-mar-2020
BERTACCHINI, Jessika
PALUMBO, Carla
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Descrizione: tesi di dottorato
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