Ricerca di biomarkers nel tumore ovarico mediante analisi proteomica

Il carcinoma ovarico rappresenta la quarta causa di morte nel sesso femminile in Europa e negli Stati Uniti. Nell’80 % dei casi infatti, la diagnosi avviene in uno stadio avanzato poiché la maggior parte delle neoplasie ovariche rimane clinicamente asintomatica negli stadi I e II. La sola terapia chirurgica assicura una sopravvivenza a cinque anni del 90 % delle pazienti diagnosticate allo stadio I, percentuale che si riduce al 35% negli stadi più avanzati. Il nostro obbiettivo è quello di utilizzare l’elettroforesi bidimensionale (2DE) e la spettrometria di massa per identificare e caratterizzare nuovi specifici biomarkers tumorali ovarici che permettano di effettuare una diagnosi precoce, di monitorare la progressione tumorale e di impostare una terapia mirata. Le indagini preliminari sono state effettuate su campioni bioptici di tessuto ovarico sano e tumorale, e su liquido proveniente da lavaggio peritoneale. Le proteine sono state estratte da circa 100 mg di tessuto congelato in azoto liquido, polverizzato in un mortaio e risospeso in tampone di lisi contenente urea, tiourea, CHAPS, Tris-HCl, ampholine pH 3-10 e inibitori delle proteasi. Dopo incubazione a temperatura ambiente per un’ora, i campioni sono stati sonicati e centrifugati. Il pellet, ottenuto dopo precipitazione in acetone freddo, è stato risospeso in un buffer di reidratazione (urea, tiourea, CHAPS, DTT e ampholine) e il contenuto proteico totale misurato con il metodo Bradford. L’isoelettrofocalizzazione (IEF) è stata effettuata caricando 80 g di proteine totali su IPG strips a range di pH 3-10 non lineare, fino al raggiungimento di 70000 Vh finali. Le proteine focalizzate sono state ridotte con DTT e alchilate con Iodoacetamide in tampone di equilibrazione (Urea, Tris-HCl, Glicerolo, SDS, Blu di Bromofenolo) prima della separazione elettroforetica su gels di poliacrilamide (SDS–PAGE), a concentrazione omogenea 10% e a gradiente 8-16%. I gel sono stati infine colorati con metodica Silver-staining massa-compatibile. L’analisi con il programma PDQuest ha evidenziato la presenza di numerosi spot proteici differenzialmente espressi nei campioni tumorali rispetto ai controlli sani; la spettrometria di massa ESI-Q-TOF-MS/MS porterà all’identificazione delle proteine di interesse. Per quanto riguarda il liquido derivato da lavaggio peritoneale, prima dell’analisi 2DE le aliquote prelevate sono state concentrate con filtri Amicon aventi cut-off di PM 5 KDa. Parallelamente alla 2DE, sui campioni tissutali è stata effettuata anche l’analisi con tecnologia SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation-Time of Flight). I risultati ottenuti hanno evidenziato variazioni significative dell’espressione di numerose proteine, soprattutto a basso peso molecolare (<20 KDa). Lo scopo dello studio ha la finalità di giungere all’identificazione di biomarcatori specifici del tumore ovarico che possono essere evidenziati anche nel liquido peritoneale ed eventualmente nel siero, fungendo da fattori prognostici della malattia ed anche predittivi di risposta al trattamento con derivati del platino.