Il trattamento del cancro mediante la chemioterapia tradizionale è spesso ostacolato dall’alta tossicità sistemica e dalla scarsa selettività dei principi attivi. La tecnologia siRNA (Small Interfering RNAs) basata sulla transfezione di ODN RNA antisenso, disegnati ad hoc per riconoscere e bloccare l’RNA messaggero target, rappresenta un’innovazione nelle strategie attuate in gene-silencing mostrando evidenti vantaggi anche in campo oncologico rispetto ai tradizionali chemioterapici. [1]Il linfoma effusivo delle cavità sierose (PEL), oggetto della ricerca, è un particolare tipo di linfoma associato invariabilmente all’infezione di HHV-8, con opzioni terapeutiche convenzionali limitate e non efficaci.[2] La disregolazione specifica mediata da siRNA del network di trascrizione della cellula malata rappresenta, ad oggi, una possibile alternativa nel trattamento della patologia. Considerando l’instabilità in vivo dei siRNAs associata alla loro scarsa capacità di penetrazione cellulare, il successo della strategia di silenziamento è strettamente dipendente dall’utilizzo di sistemi di delivery capaci di proteggere e trasportare selettivamente l’attivo nella cellula malata[3]. I liposomi, ed in particolare quelli cationici, sono sistemi di veicolazione e direzionamento innovativi, studiati e utilizzati da diversi anni, per la loro capacità di stabilizzare e trasferire materiale genico al bersaglio; la modificazione superficiale con molecole stabilizzanti (es PEG) e ligando selettive quali anticorpi monoclonali, peptidi ed aptameri garantisce la veicolazione e selettività del sistema [4,5].In studi preliminari, abbiamo dimostrato come sistemi liposomiali “stealth” modificati con anticorpo anti CD-138 specificamente riconosciuto da proteoglicani largamente espressi sulle cellule linfomatose, risultino altamente efficienti nella complessazione e stabilizzazione di materiale genico. Tali immunoliposomi sono stati testati quali carriers di un oligonucleotide modello (ODN-FITC) su cellule BCBL-1 (linea cellulare di PEL) evidenziando una buona capacità di trasferimento e di targeting valutata mediante citofluorimetria e microscopia confocale [6]. Tali evidenze sono risultate basilari per intraprendere nuovi studi di ottimizzazione di sistemi veicolanti siRNA specifici nel silenziamento di fattori trascrizionali dominanti dello stadio plasmacellulare (knock-down di BLIMP1/PRDM1) in cellule PEL. In questa ricerca sono stati formulati e caratterizzati vettori liposomiali (Lp) utilizzando lipidi neutri e cationici (Dotap e DC-Chol). Tali liposomi sono stati complessati con siRNAs e caratterizzati (elettroforesi su gel di agarosio, PCS ed AFM); i complessi ottenuti utilizzando il lipide cationico Dotap risultano caratterizzati da strutture definite e riproducibili, di dimensioni prossime a 350nm che efficientemente proteggono i siRNAs, mostrando inoltre una buona stabilità dopo incubazione in siero. I vettori sono stati testati in vitro su cellule BCBL-1; i dati preliminari evidenziano come i lipoplessi siano abili nel trasferire il materiale genico a livello citoplasmatico. L’inibizione della proteina bersaglio produce un effetto dose dipendente a concentrazioni superiori a 50nM evidente dopo 48/72 ore dal trattamento. In particolare è stata osservata un elevata induzione di necrosi /apoptosi mediante test annessina/propidio associata ad una significativa inibizione della proliferazione cellulare. E’ stata inoltre valutata la peghilazione come strategia per aumentare il tempo di permanenza in circolo oltre ad offrire il supporto per il legame con anticorpi specifici verso il PEL (anti.CD-138).[1] Oh YK, Park TG (2009). Adv. Drug Deliv Rev. 61: 850–862.[2] Carbone A, Gloghini A (2007). BJH review. 140: 13–24.[3] Whitehea KA , Langer R, Anderson DG (2009). Nature Review. 8:129-138.[4] Ruozi B, Belletti D, Tombesi A, Tosi G, Bondioli L, Forni F, Vandelli M A (2011). Int J Nanomed. 6:557–563.[5] Ruozi B, Battini R, Montanari M, Mucci A, Tosi G, Forni F, Vandelli M A (2007). Nanomedicine:NBM. 3: 1-13.[6] Ruozi B, Riva G, Belletti D, Tosi G, Barozzi P, Luppi M, Forni F, Vandelli MA (2010). Nanomedicine UK 5:1051-1064.

KNOCK-DOWN DI BLIMP1/PRDM1 IN CELLULE PEL MEDIANTE siRNA; OTTIMIZZAZIONE DEL SISTEMA DI TRANSFEZIONE E STUDI IN VITRO / Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Tosi, Giovanni; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Forni, Flavio; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara. - STAMPA. - -:(2011), pp. 252-253. ((Intervento presentato al convegno 51° Simposio AFI tenutosi a Rimini nel 8-10 Giugno 2011.

KNOCK-DOWN DI BLIMP1/PRDM1 IN CELLULE PEL MEDIANTE siRNA; OTTIMIZZAZIONE DEL SISTEMA DI TRANSFEZIONE E STUDI IN VITRO

BELLETTI, Daniela;RIVA, Giovanni;TOSI, Giovanni;BAROZZI, Patrizia;LUPPI, Mario;FORNI, Flavio;VANDELLI, Maria Angela;RUOZI, Barbara
2011

Abstract

Il trattamento del cancro mediante la chemioterapia tradizionale è spesso ostacolato dall’alta tossicità sistemica e dalla scarsa selettività dei principi attivi. La tecnologia siRNA (Small Interfering RNAs) basata sulla transfezione di ODN RNA antisenso, disegnati ad hoc per riconoscere e bloccare l’RNA messaggero target, rappresenta un’innovazione nelle strategie attuate in gene-silencing mostrando evidenti vantaggi anche in campo oncologico rispetto ai tradizionali chemioterapici. [1]Il linfoma effusivo delle cavità sierose (PEL), oggetto della ricerca, è un particolare tipo di linfoma associato invariabilmente all’infezione di HHV-8, con opzioni terapeutiche convenzionali limitate e non efficaci.[2] La disregolazione specifica mediata da siRNA del network di trascrizione della cellula malata rappresenta, ad oggi, una possibile alternativa nel trattamento della patologia. Considerando l’instabilità in vivo dei siRNAs associata alla loro scarsa capacità di penetrazione cellulare, il successo della strategia di silenziamento è strettamente dipendente dall’utilizzo di sistemi di delivery capaci di proteggere e trasportare selettivamente l’attivo nella cellula malata[3]. I liposomi, ed in particolare quelli cationici, sono sistemi di veicolazione e direzionamento innovativi, studiati e utilizzati da diversi anni, per la loro capacità di stabilizzare e trasferire materiale genico al bersaglio; la modificazione superficiale con molecole stabilizzanti (es PEG) e ligando selettive quali anticorpi monoclonali, peptidi ed aptameri garantisce la veicolazione e selettività del sistema [4,5].In studi preliminari, abbiamo dimostrato come sistemi liposomiali “stealth” modificati con anticorpo anti CD-138 specificamente riconosciuto da proteoglicani largamente espressi sulle cellule linfomatose, risultino altamente efficienti nella complessazione e stabilizzazione di materiale genico. Tali immunoliposomi sono stati testati quali carriers di un oligonucleotide modello (ODN-FITC) su cellule BCBL-1 (linea cellulare di PEL) evidenziando una buona capacità di trasferimento e di targeting valutata mediante citofluorimetria e microscopia confocale [6]. Tali evidenze sono risultate basilari per intraprendere nuovi studi di ottimizzazione di sistemi veicolanti siRNA specifici nel silenziamento di fattori trascrizionali dominanti dello stadio plasmacellulare (knock-down di BLIMP1/PRDM1) in cellule PEL. In questa ricerca sono stati formulati e caratterizzati vettori liposomiali (Lp) utilizzando lipidi neutri e cationici (Dotap e DC-Chol). Tali liposomi sono stati complessati con siRNAs e caratterizzati (elettroforesi su gel di agarosio, PCS ed AFM); i complessi ottenuti utilizzando il lipide cationico Dotap risultano caratterizzati da strutture definite e riproducibili, di dimensioni prossime a 350nm che efficientemente proteggono i siRNAs, mostrando inoltre una buona stabilità dopo incubazione in siero. I vettori sono stati testati in vitro su cellule BCBL-1; i dati preliminari evidenziano come i lipoplessi siano abili nel trasferire il materiale genico a livello citoplasmatico. L’inibizione della proteina bersaglio produce un effetto dose dipendente a concentrazioni superiori a 50nM evidente dopo 48/72 ore dal trattamento. In particolare è stata osservata un elevata induzione di necrosi /apoptosi mediante test annessina/propidio associata ad una significativa inibizione della proliferazione cellulare. E’ stata inoltre valutata la peghilazione come strategia per aumentare il tempo di permanenza in circolo oltre ad offrire il supporto per il legame con anticorpi specifici verso il PEL (anti.CD-138).[1] Oh YK, Park TG (2009). Adv. Drug Deliv Rev. 61: 850–862.[2] Carbone A, Gloghini A (2007). BJH review. 140: 13–24.[3] Whitehea KA , Langer R, Anderson DG (2009). Nature Review. 8:129-138.[4] Ruozi B, Belletti D, Tombesi A, Tosi G, Bondioli L, Forni F, Vandelli M A (2011). Int J Nanomed. 6:557–563.[5] Ruozi B, Battini R, Montanari M, Mucci A, Tosi G, Forni F, Vandelli M A (2007). Nanomedicine:NBM. 3: 1-13.[6] Ruozi B, Riva G, Belletti D, Tosi G, Barozzi P, Luppi M, Forni F, Vandelli MA (2010). Nanomedicine UK 5:1051-1064.
51° Simposio AFI
Rimini
8-10 Giugno 2011
Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Tosi, Giovanni; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Forni, Flavio; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara
KNOCK-DOWN DI BLIMP1/PRDM1 IN CELLULE PEL MEDIANTE siRNA; OTTIMIZZAZIONE DEL SISTEMA DI TRANSFEZIONE E STUDI IN VITRO / Belletti, Daniela; Riva, Giovanni; Tosi, Giovanni; Barozzi, Patrizia; Luppi, Mario; Forni, Flavio; Vandelli, Maria Angela; Ruozi, Barbara. - STAMPA. - -:(2011), pp. 252-253. ((Intervento presentato al convegno 51° Simposio AFI tenutosi a Rimini nel 8-10 Giugno 2011.
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