I raggi UVB sono le radiazioni maggiormente responsabili degli effetti fotobiologici a livello cutaneo. Come è noto dalla letteratura, i raggi UVB inducono apoptosi nei cheratinociti umani normali, ma i segnali ed i meccanismi che danno inizio alla risposta apoptotica sono ancora in parte da definire. Diversi studi hanno evidenziato che i ceramici, una particolare classe di sfingolipidi, sono implicati nella traduzione dei segnali intracellulari partecipando a diversi processi quali la modulazione del ciclo cellulare, l’induzione del processo di differenziazione e/o del fenomeno apoptotico. I ceramici intracellulari possono venire sintetizzati attraverso varie vie e una di queste implica l’attivazione di particolari enzimi, le sfingomielinasi acida e neutra, che idrolizzano la sfingomielina in fosfocolina e ceramide. Recenti studi in vitro su linee cellulari leucemiche hanno dimostrato che il glutatione (GSH), molecola ad attività antiossidante, inibisce in maniera dose-dipendente l’attivazione della sfingomielinasi neutra (N-SMase). Con il presente studio riportiamo che il pre-trattamento con GSH esogeno inibisce l’attivazione della N-SMase indotta da UVB, riduce la generazione di ceramici intracellulari e blocca parzialmente il processo apoptotico. Cheratinociti umani normali provenienti da interventi di chirurgia plastica sono stati coltivati su fibroblasti 3T3 trattati con mitomicina in terreno di coltura Dulbecco ed Ham F12 addizionato del 10% di siero di vitello fetale. A subconfluenza le cellule sono state pre-trattate con GSH 5mM, per 2h a 37°C e successivamente irradiate con UVB alla dose di 75mJ/ cm2. A tempi diversi le cellule sono state raccolte per valutare l’ attività enzimatica della N-SMase, la produzione di ceramici intracellulari, tramite cromatografia su strato sottile e il clivaggio della proteina poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), come marker di apoptosi, tramite western-blot. L’esposizione ai raggi UVB induce attivazione della SMase neutra a 15 minuti con picco a 30 minuti dallo stimolo con UVB e idrolisi della sfingomielina con rapida comparsa di ceramici. L’aumento dei ceramici è risultato significativamente evidente già dopo 15 minuti dall’irradiazione UV e si mantiene fino a 24 ore. Il pre-trattamento con GSH inibisce, in modo significativo, l’attivazione in vitro della N-SMase e la produzione di ceramici a tutti i tempi studiati. L’analisi in western-blotting ha evidenziato il clivaggio di PARP a 16 ore dall’esposizione ai raggi UVB, mentre nei campioni protrattati con GSH non si osserva tale clivaggio evidenziando in questo modo un’interferenza con la trasduzione del segnale apoptotico. I nostri dati suggeriscono che il glutatione endogeno sia uno dei fattori che regolano l’attivazione della N-SMase nel processo di apoptosi indotta dai raggi UVB nei cheratinociti umani normali in coltura.

Il glutatione endogeno regola l'attivazione della n-smase nel processo di apoptosi indotta dai raggi UVB nei cheratinociti umani normali in coltura / Magnoni, Cristina; Euclidi, Emanuela; Bertazzoni, Giorgia; Benassi, Luisa; Vaschieri, Cristina; Seidenari, Stefania; Giannetti, Alberto. - STAMPA. - .:(2001), pp. 264-264. ((Intervento presentato al convegno Congresso Nazionale Unificato di Dermatologia e Venereologia-ADOI-SIDEV tenutosi a Roma nel 11-15 giugno.

Il glutatione endogeno regola l'attivazione della n-smase nel processo di apoptosi indotta dai raggi UVB nei cheratinociti umani normali in coltura.

MAGNONI, Cristina;EUCLIDI, Emanuela;BERTAZZONI, Giorgia;BENASSI, Luisa;VASCHIERI, Cristina;SEIDENARI, Stefania;GIANNETTI, Alberto
2001

Abstract

I raggi UVB sono le radiazioni maggiormente responsabili degli effetti fotobiologici a livello cutaneo. Come è noto dalla letteratura, i raggi UVB inducono apoptosi nei cheratinociti umani normali, ma i segnali ed i meccanismi che danno inizio alla risposta apoptotica sono ancora in parte da definire. Diversi studi hanno evidenziato che i ceramici, una particolare classe di sfingolipidi, sono implicati nella traduzione dei segnali intracellulari partecipando a diversi processi quali la modulazione del ciclo cellulare, l’induzione del processo di differenziazione e/o del fenomeno apoptotico. I ceramici intracellulari possono venire sintetizzati attraverso varie vie e una di queste implica l’attivazione di particolari enzimi, le sfingomielinasi acida e neutra, che idrolizzano la sfingomielina in fosfocolina e ceramide. Recenti studi in vitro su linee cellulari leucemiche hanno dimostrato che il glutatione (GSH), molecola ad attività antiossidante, inibisce in maniera dose-dipendente l’attivazione della sfingomielinasi neutra (N-SMase). Con il presente studio riportiamo che il pre-trattamento con GSH esogeno inibisce l’attivazione della N-SMase indotta da UVB, riduce la generazione di ceramici intracellulari e blocca parzialmente il processo apoptotico. Cheratinociti umani normali provenienti da interventi di chirurgia plastica sono stati coltivati su fibroblasti 3T3 trattati con mitomicina in terreno di coltura Dulbecco ed Ham F12 addizionato del 10% di siero di vitello fetale. A subconfluenza le cellule sono state pre-trattate con GSH 5mM, per 2h a 37°C e successivamente irradiate con UVB alla dose di 75mJ/ cm2. A tempi diversi le cellule sono state raccolte per valutare l’ attività enzimatica della N-SMase, la produzione di ceramici intracellulari, tramite cromatografia su strato sottile e il clivaggio della proteina poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), come marker di apoptosi, tramite western-blot. L’esposizione ai raggi UVB induce attivazione della SMase neutra a 15 minuti con picco a 30 minuti dallo stimolo con UVB e idrolisi della sfingomielina con rapida comparsa di ceramici. L’aumento dei ceramici è risultato significativamente evidente già dopo 15 minuti dall’irradiazione UV e si mantiene fino a 24 ore. Il pre-trattamento con GSH inibisce, in modo significativo, l’attivazione in vitro della N-SMase e la produzione di ceramici a tutti i tempi studiati. L’analisi in western-blotting ha evidenziato il clivaggio di PARP a 16 ore dall’esposizione ai raggi UVB, mentre nei campioni protrattati con GSH non si osserva tale clivaggio evidenziando in questo modo un’interferenza con la trasduzione del segnale apoptotico. I nostri dati suggeriscono che il glutatione endogeno sia uno dei fattori che regolano l’attivazione della N-SMase nel processo di apoptosi indotta dai raggi UVB nei cheratinociti umani normali in coltura.
Congresso Nazionale Unificato di Dermatologia e Venereologia-ADOI-SIDEV
Roma
11-15 giugno
Magnoni, Cristina; Euclidi, Emanuela; Bertazzoni, Giorgia; Benassi, Luisa; Vaschieri, Cristina; Seidenari, Stefania; Giannetti, Alberto
Il glutatione endogeno regola l'attivazione della n-smase nel processo di apoptosi indotta dai raggi UVB nei cheratinociti umani normali in coltura / Magnoni, Cristina; Euclidi, Emanuela; Bertazzoni, Giorgia; Benassi, Luisa; Vaschieri, Cristina; Seidenari, Stefania; Giannetti, Alberto. - STAMPA. - .:(2001), pp. 264-264. ((Intervento presentato al convegno Congresso Nazionale Unificato di Dermatologia e Venereologia-ADOI-SIDEV tenutosi a Roma nel 11-15 giugno.
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