Caratterizzazione di proteine nel tessuto e nel liquido interstiziale di neoplasie della mammella

La classificazione dei tumori della mammella si basa attualmente sui parametri clinici e sulla morfologia cellulare; l’analisi immunoistochimica utilizza un numero ristretto di fattori prognostici e predittivi correlati a diverse funzioni cellulari come la proliferazione, l’angiogenesi, l’invasione e la metastatizzazione. Questi parametri si limitano a classificare i pazienti in sottogruppi con differente prognosi mentre l’uso di nuove tecnologie, quali lo studio delle proteine attraverso elettroforesi bidimensionale (2D), potrebbe portare ad un approccio terapeutico individualizzato e ad una ottimizzazione del trattamento. Lo scopo del nostro studio è quello di individuare nuovi markers nell’ambito dei tumori invasivi della mammella confrontando il profilo di espressione proteica di tessuto normale, patologico, di TIF (tumoral interstitial fluid) e di NIF (normal interstitial fluid). Nel microambiente tumorale si concentrano infatti un gran numero di molecole in parte secrete, in parte trasportate da vescicole di membrana o liberate in seguito a morte cellulare. Abbiamo ottenuto 8 biopsie mammarie da pazienti affette da carcinoma duttale infiltrante (G3) e carcinoma lobulare infiltrante (G2/3). L’indagine è stata condotta utilizzando circa 200 mg di tessuto mammario di carcinoma duttale e di tessuto adiacente sano. I frammenti di biopsia, sospesi in tampone PBS, sono stati incubati in CO2 5% a 37°C per un’ora e successivamente centrifugati 20 min. a 3000g. Da questa coltura è stato recuperato e analizzato il surnatante contenente le proteine rilasciate dal tessuto. Successivamente l’estrazione proteica è stata effettuata anche sul pellet di tessuto bioptico polverizzato in azoto e sonicato in tampone di lisi. Per ciascuna analisi 100ug di proteine sono state sottoposte ad elettroforesi 2D e visualizzate con metodica silver staining. Gli spots di interesse sono stati caratterizzati con la tecnica HPLC-ESI-MS/MS in seguito a purificazione e digestione con tripsina. L’analisi preliminare delle mappe bidimensionali attraverso il programma PDQuest (BIO-RAD) ha evidenziato spots proteici la cui intensità variava significativamente nei campioni tumorali. Da segnalare un’aumentata espressione dell’oncogene mitogeno DJ-1(PARK 7), coinvolto in pathways di trasduzione del segnale Ras dipendenti e delle proteine LYPA (Acyl-protein thioesterase) e LDHB (lactate dehydrogenase B) la cui overespressione è stata segnalata in linee cellulari di tumore mammario resistenti al trattamento anti-estrogenico. È stato inoltre riscontrato un aumentato livello di PSA1 (Prostatic Specific Antigen), una proteasi serinica associata in letteratura ad un basso indice di proliferazione e ad una prognosi favorevole. L’analisi e il confronto di un maggiore numero di casi permetterà di chiarire il significato e di ottenere informazioni specifiche sul pattern di espressione genica dei differenti stadi e istotipi del carcinoma mammario. Inoltre il confronto con pattern proteici sierici potrebbe essere di aiuto nell’identificazione di nuovi e predittivi marker ematici di neoplasia.