Ricerca di markers diagnostici, prognostici e predittivi in carcinomi mammari attraverso analisi proteomica

Le basi molecolari dei tumori sporadici della mammella sono solo in parte conosciute: un comune meccanismo molecolare, che è stato riportato in circa il 75% dei casi, è l’attivazione della proteina oncogenica ad attività Serin/Treonin chinasica AKT. Una delle principali funzioni di pAKT (la cui forma attiva è fosforilata) è quella di promuovere la sopravvivenza cellulare mediata da fattori di crescita bloccando i meccanismi intrinseci dell’apoptosi. Recentemente numerosi studi si sono concentrati sull’approfondimento del ruolo dell’oncoproteina AKT nel carcinoma mammario; la conclusione comune a questi studi è che si possano ottenere benefici clinici rilevanti dall’appropriata combinazione terapeutica tra chemioterapici convenzionali e inibitori specifici di pAKT. Sarebbe inoltre di notevole importanza chiarire in che modo la valutazione dell’attività di pAKT possa essere interpretata ai fini diagnostici, prognostici e predittivi in pazienti con carcinoma mammario. Questo progetto di ricerca si propone di approfondire questi aspetti utilizzando un approccio basato su tecniche di analisi proteomica. Su diversi tipi di linee continue di carcinoma mammario con diverse caratteristiche e diverso grado di aggressività (ErbB2+ / ErbB2- / BRCA1 mutato / BRCA1 w.t.) sono stati eseguiti e sono tuttora in corso, esperimenti d’inibizione/deplezione della proteina pAkt. In particolare dalla linea SKBr3 è stato possibile ottenere estratti proteici contenenti una discreta quota di pAKT; inoltre esperimenti di immunoprecipitazione selettiva hanno consentito di isolare gli interattomi di pAKT e di AKT non fosforilata. Questi immunoprecipitati sono poi stati sottoposti ad elettroforesi bidimensionale e gli spot indicativi di proteine varianti (associate quindi ad una forma rispetto all’altra) analizzati tramite spettrometria di massa. Attualmente una sola nuova potenziale proteina cliente, Elongation Factor 1 alfa (EF1a), è stata identificata ed è in via di caratterizzazione. Per approfondire il ruolo di questa proteina (nota per essere iperespressa in diversi tipi di carcinoma tra i quali l’ovarico, il mammario e il prostatico) sono stati condotti studi di “RNAinterference” che hanno permesso di asserire che in cellule di carcinoma mammario la riduzione dell’espressione di EF1a (livelli diminuiti del 60%) porta ad una riduzione del 30% della clonogenicità. Sembra inoltre che diminuiti livelli d’espressione di EF1 associati a trattamenti a base di 17AAG (inibitore selettivo dell’attività di HSP90 che causa forti riduzioni ai livelli di pAKT) abbiano un effetto sinergico nella riduzione della proliferazione cellulare. Parallelamente a questi studi, stiamo programmando un’analisi globale di tutte le proteine che manifestano una espressione differenziale dopo l’inibizione di pAKT (globale, perché non si riferisce alle sole proteine dell’interattoma, ma all’estratto totale). Questo verrà realizzato tramite confronto diretto delle mappe proteiche ottenute dopo elettroforesi bidimensionale degli estratti totali (trattamento inibitorio specifico vs. controllo) individuando e identificando gli “spots” che rappresentano proteine la cui espressione varia a seguito dell’inibizione dell’attività chinasica di pAKT. La scoperta di nuove proteine substrato della attività chinasica di pAKT e l’approfondimento dei meccanismi biologici e molecolari da essa regolati, rappresentano un importante punto di partenza per la progettazione di strategie terapeutiche ottimali e per la validazione di nuovi markers diagnostici, prognostici o predittivi in situazioni di carcinoma mammario.