Identificazione di hotspot di integrazione in cheratinociti primari umani trasdotti con vettori γRV: potenziali implicazioni per applicazioni cliniche

Gene Therapy (GT) achieved remarkable results in treating monogenic diseases deemed incurable by conventional medicine. Although successful clinical trials have demonstrated the feasibility of GT for hematological and skin genetic disorders, genotoxicity concerns on the use of gamma-retroviral vectors (γRV) hamper their approval by regulatory authorities. Indeed, in-depth characterization of γRV integration pattern elucidated insertional mutagenesis events, particularly in hematopoietic stem cells, highlighting hotspots of integration in proto-oncogene-enhancer regions. Today, ten patients affected by Epidermolysis Bullosa (EB), a congenital skin disease, have been grafted with γRV-transgenic epidermal sheets, with no signs of insertional mutagenesis. Although open-chromatin-integration preferences have been observed in γRV-transduced keratinocytes, no hotspots of integration have been yet described. In this thesis, we implemented two different Integration Site (IS) analysis assays, LAM-PCR/Illumina and Cas9/Nanopore, to better characterize integration profile across the genome of eight γRV-transduced human primary keratinocytes, either from normal or EB-diseased donors. Thus, a conserved integration pattern with putative hotspots has been identified. Furthermore, the use of two different IS analysis allowed to determine the pros and cons of the two techniques, especially highlighting the limits of the gold standard LAM-PCR/Illumina technique in detecting the complete IS profile. The identification of a common integration pattern with putative hotspots of integration might contribute to understand why insertional events have never been observed in skin-GT trials. This knowledge combined with the use of the new SIN-γRV vectors could lead to definitively support its use in skin-GT.

La terapia genica ha raggiunto notevoli risultati nel trattamento delle malattie monogeniche considerate incurabili dalla medicina convenzionale. Numerosi studi clinici hanno dimostrato con successo la possibilità di trattare disordini genetici, sia ematologici che della pelle, mediante terapia genica. Nonostante ciò, le preoccupazioni generate dalla potenziale insorgenza di genotossicità causata dall’uso di vettori retrovirali gamma (γRV) ne hanno ostacolato l’approvazione da parte degli organi regolatori. Un’approfondita caratterizzazione del profilo di integrazione dei γRV ha difatti evidenziato l’insorgenza di eventi di mutagenesi inserzionale, specialmente in cellule staminali ematopoietiche, dovuti alla presenza di hotspot di integrazione in regioni enhancers di proto-oncogeni. Oggigiorno, dieci pazienti affetti da Epidermolisi Bollosa (EB), una malattia congenita rara della pelle, sono stati trapiantati con foglietti di epidermide transgenica e nessun evento di mutagenesi inserzionale è stato identificato. Sebbene sia già stata caratterizzata una preferenza dei γRV nell’integrare porzioni aperte della cromatina nei cheratinociti umani, rimane ipotetica la presenza di hotspot di integrazione nel genoma di queste cellule. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare in maniera dettagliata il profilo di integrazione dei γRV in otto culture di cheratinociti primari umani, ottenuti sia da pazienti EB che da donatori sani. A tal scopo, sono stati usati due differenti approcci di analisi delle integrazioni (IS), LAM-PCR/Illumina e Cas9/Nanopore, permettendo così la caratterizzazione di un profilo di integrazione comune evidenziando hotspot putativi. Inoltre, usando due differenti tecniche, sono stati determinati i loro vantaggi e svantaggi, sottolineando specialmente i grossi limiti della tecnica, LAM-PCR/Illumina, considerato l’approccio per eccellenza. L’identificazione di un pattern di integrazione comune con hotspot putativi potrebbe esplicare il motivo per cui eventi di mutagenesi inserzionale non siano mai stati osservati in pazienti trattati con pelle transgenica. Questa conoscenza, combinata con l’uso dei nuovi vettori SIN-γRV, potrebbe portare al supporto definitivo alla commercializzazione dell’applicazione clinica di questi epiteli geneticamente corretti.